非同源末端连接（NHEJ）概述
示意图展示了DNA双链断裂（DSBs）及其通过非同源末端连接（NHEJ）修复的过程（顶部）。Ku70-Ku80异二聚体结合到DSBs上，并促进NHEJ聚合酶、核酸酶和连接酶复合物的后续结合。这些酶可以按照任意顺序作用于DSBs，进行切割或添加核苷酸。多个轮次的切割和添加均可发生，并且在两个DNA末端进行的核酸酶和聚合酶活性似乎是相互独立的。DNA末端之间的微同源序列（虚线框）可能已存在，或是在聚合酶以模板非依赖的方式添加核苷酸时新形成，通常用于指导末端连接。该过程具有错误倾向，可能导致修复连接处产生多样化的DNA序列（底部）。然而，NHEJ也能够在不丢失任何DNA末端核苷酸且不添加额外核苷酸的情况下连接两个DNA末端。新增的核苷酸以绿色小写字母表示。

DNA双链断裂（DSB）及其修复的必要性

DNA双链断裂（DSB）是最严重的DNA损伤类型，可能导致染色体大片段丢失、基因组不稳定性，甚至细胞死亡或癌症。哺乳动物细胞中，每天约发生10次DSB，主要由电离辐射、活性氧（ROS）、复制错误和内源性核酸酶引起。

为了修复DSB，细胞主要依赖以下三种修复途径：

非同源末端连接（NHEJ）——主要在G1期和整个细胞周期中发挥作用。
同源重组修复（HR）——在S/G2期活跃，需要同源DNA作为模板。
替代末端连接（a-EJ）和单链退火（SSA）——依赖微同源序列，往往伴随大片段缺失。

NHEJ是哺乳动物细胞中最主要的DSB修复方式。

图 2 | 非同源末端连接（NHEJ）相关蛋白及其已知相互作用

a | 非同源末端连接（NHEJ）DNA蛋白激酶（DNA‑PK）复合物由Ku70和Ku80的异二聚体以及DNA-PK催化亚基（DNA-PKcs）组成。Ku70和Ku80包含冯·维勒布兰德（vWA）结构域、Ku核心结构域和核定位信号（NLS）。Ku70还具有SAP（SAF‑A/B、Acinus和PIAS）结构域。DNA-PKcs由N端结构域（包含与其激活相关的PQR和ABCDE自磷酸化簇）、FAT（FRAP、ATM、TRRAP）结构域、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）结构域和FAT-C（羧基端）结构域组成。

b | NHEJ的核酸酶包括Artemis和Aprataxin及PNKP样因子（APLF）。Artemis具有催化β-内酰胺酶结构域、切割和多聚腺苷酸化特异性因子（β-CASP）结构域，以及无序的C端。氨基酸454–458与氨基酸1–7结合，可自抑制Artemis活性。APLF由叉头相关（FHA）结构域、中间（MID）结构域和多（ADP-核糖）结合锌指（PBZ）结构域组成。

c | 参与NHEJ的聚合酶包括Pol λ、Pol μ和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）。它们包含BRCA1 C端（BRCT）结构域、裂解酶结构域和核苷酸转移酶结构域。

d | DNA连接酶复合物由DNA连接酶IV、X射线修复交互互补蛋白4（XRCC4）、XRCC4样因子（XLF）和XRCC4及XLF的旁系同源蛋白（PAXX）组成。DNA连接酶IV由N端DNA结合结构域、催化核心结构域和XRCC4相互作用结构域（XID）组成，XID被BRCT I和BRCT II结构域包围。XRCC4、XLF和PAXX在结构上相似，均具有N端头部结构域、螺旋结构域和C端。蛋白质结构域以实色表示，连接区域以灰色表示。

非同源末端连接（NHEJ）的机制

NHEJ的基本过程包括：

断裂识别和结合

Ku70–Ku80异二聚体（Ku复合体） 作为“工具带”识别并结合DSB，使其他NHEJ相关蛋白募集至损伤位点。

末端加工

许多DSB具有不兼容的DNA末端，如5'或3'突出端，或氧化损伤。主要的加工酶包括：

Artemis：核酸酶，切割5'和3'突出端，使其适合连接。
DNA-PKcs：激活Artemis并调节修复。
APLF、MRN、CtIP：调控末端切割。

DNA合成

若DNA末端缺失碱基，Pol X家族（Pol μ 和 Pol λ） 负责填补缺失的碱基。Pol μ 主要为模板非依赖合成，而Pol λ 主要进行模板依赖填补。

DNA连接

最终，由DNA连接酶IV（Ligase IV）- XRCC4 - XLF 复合物完成DNA连接。

NHEJ的关键蛋白

NHEJ过程涉及多个蛋白质复合物：

NHEJ的不同亚途径

根据DNA末端的类型和修复需求，NHEJ可分为不同的亚途径：

直接连接（适用于平末端）：Ku70/80结合DNA末端，直接由Ligase IV-XRCC4完成连接。
核酸酶介导的修复（适用于非兼容末端）：Artemis参与末端切割，产生可连接的末端。
聚合酶介导的修复（适用于碱基缺失）：Pol μ 和 Pol λ 参与碱基填补。

图 4 | 双链断裂（DSB）修复通路的选择

DNA双链断裂（DSBs）可以通过经典非同源末端连接（NHEJ）通路、替代末端连接（a-EJ）通路、单链退火（SSA）通路或同源重组（HR）通路进行修复。影响修复通路选择的主要因素是DNA末端切割（resection）的程度。

p53结合蛋白1（53BP1）是一种染色质重塑因子，也是NHEJ的正向调节因子。虽然Artemis和DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）复合物可进行一定程度的DNA末端切割（通常<20个核苷酸），但NHEJ修复途径并不依赖大规模的末端切割，DNA末端主要受到Ku70-Ku80复合物的保护。

相比之下，羧基端结合蛋白相互作用蛋白（CtIP）和MRN复合物（由MRE11、RAD50和NBS1（Nijmegen断裂综合征蛋白1）组成）负责大规模的5' → 3'切割，使DNA末端形成单链DNA（ssDNA）区域，以促进a-EJ、SSA和HR通路。SSA通常需要>20 bp的微同源序列，而a-EJ所需的微同源序列<25 bp。

多聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）和DNA聚合酶θ（Pol θ）在a-EJ通路中起重要作用。Bloom综合征RecQ样解旋酶（BLM）和外切核酸酶1（EXO1）进一步增强DNA末端切割，而复制蛋白A（RPA）可结合ssDNA，促进SSA和HR通路。RAD52介导的大范围同源序列退火是SSA通路的关键步骤，着色性干皮病F组（XPF）-ERCC1复合物会在连接前切除剩余的3'突出端。

相比之下，RAD51介导的链交换及其与BRCA1、BRCA2和RAD54的相互作用对于HR通路至关重要。

术语解释：

PAXX：XRCC4和XLF的旁系同源蛋白
XLF：XRCC4样因子
XRCC4：X射线修复交互互补蛋白4

NHEJ与其他修复途径的关系

替代末端连接（a-EJ）

需要更长的微同源序列（2-20 bp）。
依赖DNA聚合酶θ（Pol θ）和PARP1。
修复过程中往往伴随大片段缺失。

单链退火（SSA）

需要>20 bp的同源序列。
依赖MRN复合物和RAD52。
过程导致大片段DNA丢失，极易引发基因组不稳定性。

同源重组修复（HR）

依赖BRCA1/2和RAD51。
仅在S/G2期进行。
通过复制姐妹染色单体进行精准修复。

NHEJ在整个细胞周期中均可发生，而HR和SSA主要在S/G2期进行。

NHEJ的生物学重要性及其在疾病中的作用

NHEJ在免疫系统中的作用

V(D)J重组：B/T淋巴细胞的抗原受体基因通过NHEJ连接不同的V、D、J片段。
免疫球蛋白类别转换（CSR）：NHEJ介导IgM到IgG/IgA/IgE的转换。

NHEJ缺陷与人类疾病

Artemis突变：导致严重联合免疫缺陷（SCID）。
Ligase IV突变：导致微头畸形、发育迟缓。
Ku缺陷：极少见，但可能导致基因组不稳定性和癌症。

NHEJ与癌症

由于NHEJ是主要的DSB修复途径，其突变会导致基因组不稳定性，进而增加癌症风险。
某些肿瘤细胞中过度活跃的NHEJ：可能导致异常染色体重排，如染色体碎裂症（chromothripsis）。

参考文献

Chang, H., Pannunzio, N., Adachi, N. et al. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 495–506 (2017). https://doi.org/10.1038/nrm.2017.48

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DrLeo

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