靶向蛋白降解技术（TPD）展现出了广阔的治疗前景。相较于传统抑制剂，TPD在剂量控制、副作用减少以及针对“无成药性”蛋白质的靶向治疗方面展现出了潜在优势。此外，它还能有效克服现有小分子抑制剂（SMIs）的耐药性问题。由于TPD理论上能够结合目标蛋白的任意位点以引发降解，而传统小分子抑制剂则必须在特定结构域中发挥作用，这使得药物分子设计更加灵活便捷。
TPD的降解过程主要依赖于两种细胞自毁机制——泛素-蛋白酶体系统和溶酶体降解途径。为了更有效地靶向功能失调蛋白，科学家们已经开发出多种TPD策略，例如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）、分子胶、溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）以及自噬靶向嵌合体（AUTACs）等。这些方法为治疗各类疾病如糖尿病、癌症、自身免疫性疾病等提供了新的可能。
功能失调蛋白的积累是导致多种疾病发生的关键因素，例如tau蛋白的异常积累与阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关。近期研究显示，一种名为C004019的PROTAC分子能够选择性促进tau蛋白的消除，这一发现为阿尔茨海默病的治疗提供了新思路。
自本世纪初以来，多种TPD策略相继问世，并已有约20种TPDs进入临床试验阶段。TPD技术的持续发展为新疗法的开发带来了更多可能性，同时也为药物开发提供了全新的视角和策略。本文旨在回顾TPD技术的最新进展，探讨其作为新疗法的潜力及面临的挑战。
基于泛素-蛋白酶体系统（UPS）的TDP策略
泛素-蛋白酶体系统（UPS）是细胞内调控蛋白质含量的核心蛋白水解机制。该系统由泛素分子、三种关键酶类、26S蛋白酶体以及蛋白质底物共同构成。在这一过程中，蛋白质首先被泛素标记，随后被蛋白酶体识别并降解。以三磷酸腺苷（ATP）水解反应为例，泛素激活酶E1会激活泛素并将其传递给泛素结合酶E2。接着，在E3泛素连接酶的协助下，E2酶将泛素转移至蛋白质底物上。E3泛素连接酶具有识别并选择性地将泛素结合到特定蛋白质位点的能力。最终，蛋白酶体以ATP依赖的方式催化这些泛素化的蛋白质底物进行降解。
在泛素-蛋白酶体系统（UPS）的级联反应中，E3连接酶扮演着至关重要的角色。它能够识别并泛素化标记底物蛋白质。值得一提的是，人类基因组中存在众多E3连接酶，其中一些特别适用于TDP策略，能够靶向消除多种细胞内和跨膜蛋白底物。接下来，我们将深入探讨这些方法，并总结目前的进展与面临的挑战。
01 PROTACs技术
PROTACs是一种双功能分子，其结构包含三部分：与靶蛋白结合的配体、与E3泛素连接酶结合的另一配体，以及连接这两个配体的linker。这种分子设计使得PROTAC能够同时与E3连接酶和靶蛋白结合，从而形成三元复合物。随后，靶蛋白被泛素标记并通过蛋白酶体进行靶向降解。
尽管Sakamoto在2001年首次报道了针对蛋氨酸氨基肽酶-2的PROTACs，但这些多肽类药物因膜通透性低和化学稳定性差而限制了其临床应用。然而，在2008年，小分子第二代PROTACs的开发成功引起了广泛关注。从那时起，各大药企纷纷投入资金和精力进行研发，目前已有十余种PROTACs进入临床试验阶段。
表1展示了部分目前正在临床开发中的PROTACs。与传统的小分子抑制剂（SMIs）相比，PROTACs能够降解多种等效的靶蛋白，从而增强了药效学并降低了毒性。这种独特的药理机制赋予了PROTACs出色的选择性和药效，并使它们在一定程度上具有抗耐药性的能力。此外，PROTAC技术消除了对结合受体或酶的活性位点的依赖，从而拓宽了可药物靶点的范围。
然而，PROTACs的双功能性也带来了理化性质的复杂性和不确定性。这种不确定性影响了其吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征，给PROTACs的药代动力学研究带来了挑战。同时，尽管PROTACs能有效降解蛋白质，但当目标蛋白（POI）在正常组织中是必需成分时，研究人员必须谨慎评估靶毒性的风险。此外，PROTACs的有效性还受到诸如高分子量、高疏水性、E3依赖性以及潜在脱靶毒性等特性的限制。
02 分子胶
分子胶是一种新型小分子降解剂，通过诱导靶蛋白与E3连接酶之间的蛋白-蛋白相互作用来发挥作用。与PROTACs相似，“分子胶”一词最初在20世纪90年代初被用于描述免疫抑制药物环孢素A和FK506（他克莫司）所采用的蛋白-蛋白结合机制。近年来，免疫调节亚胺药物沙利度胺及其衍生物已被证实可作为分子胶使用，它们通过招募E3泛素连接酶来降解疾病相关蛋白。此外，indisulam能够募集DDB1和CUL4相关因子15（DCAF15）E3连接酶，并引发RNA结合基序蛋白39 (RBM39)的降解。同时，小分子BI-3802作为分子胶，可以通过募集SIAH E3泛素蛋白连接酶1（SIAH1）诱导致癌转录因子B细胞淋巴瘤6（BCL6）的降解。目前，分子胶降解剂已成为研究的热点，并已有一些分子胶降解剂进入临床试验阶段。
这种新型降解剂为治疗各种严重疾病提供了新的可能。它们对恶性肿瘤、感染、炎症和免疫疾病等特征蛋白具有显著的降解效果，显示出高效的治疗潜力。与PROTACs相比，分子胶的优势在于其较低的分子量、出色的细胞渗透性和药物耐受性。
回顾分子胶的发展历程，我们发现其发现具有一定的偶然性，且由于对其调控机制的理解有限，缺乏系统的发现策略，使得合理设计分子胶仍面临挑战。因此，目前成功开发的药物仍然相对较少。尽管如此，随着研究的深入，分子胶这一领域正逐渐展现出其巨大的潜力。
近年来，研究人员还报道了一种新型的降解剂——PROTABs。这种降解剂通过将抗体臂与已知的IGF1R抗体进行组装，从而介导跨膜蛋白的降解。研究显示，PROTABs能够诱导细胞表面的IGF1R蛋白降解，且具有普适性。此外，研究人员还设计了靶向HER2和PD-L1的Protab，进一步证明了Protab策略在靶向膜蛋白方面的有效性。
尽管Protab的临床应用尚需时日，但这种方法无疑为改善药物细胞渗透性和生物利用度提供了新的思路。同时，PROTABs展现出的组织选择性和良好的生物安全性，使其在未来药物开发中具有广阔的应用前景。随着抗体工程的发展，PROTABs有望成为药物开发的一个全新领域。
基于溶酶体降解途径的TPD策略
溶酶体，作为细胞内的降解枢纽，通过内吞、吞噬和自噬等机制，负责对细胞内外物质进行降解。内吞作用使细胞能够从外界环境中摄取必需物质。而吞噬则主要针对直径大于5μm的颗粒，以受体介导的方式将其摄入并消除。自噬则是一种复杂的自降解过程，它能将细胞质中的各种成分，如蛋白质、细胞器以及病原体，送入溶酶体进行降解。目前，已经涌现出多种利用溶酶体途径来降解异常蛋白的TPD策略，诸如LYTACs、抗体融合的PROTACs（AbTACs）、ATTECs、AUTACs、靶向自噬的嵌合体（AUTOTACs），以及双特异性适配体嵌合体等。
基于溶酶体的TPD策略不仅弥补了蛋白酶体TPD策略的不足，还为靶向细胞膜内外受损细胞器和致病蛋白提供了新的可能。其中，LYTACs作为一类双功能蛋白降解物，通过将靶蛋白引导至细胞表面的溶酶体穿梭受体，实现对细胞外蛋白和膜蛋白的有效降解。这种降解途径主要由内体-溶酶体机制介导。
LYTACs的诞生可以追溯到Banik等人的研究，他们首次报道了一种由单克隆抗体和寡糖肽片段（polyM6Pn）组成的LYTAC，该降解物能够结合并诱导多种膜结合蛋白和细胞外蛋白的溶酶体降解，如载脂蛋白E表皮生长因子受体（EGFR）、PD-L1和CD71等。这一发现极大地扩展了TPD策略的应用范围，弥补了PROTACs主要针对细胞内蛋白的不足。
然而，LYTACs的应用也面临一些挑战。例如，CI-M6PR在LYTAC介导的靶标内化和降解过程中扮演着关键角色，但其并非组织特异性，可能引发某些脱靶效应。针对这一问题，Ahn等人开发了一种新型的N-乙酰半乳糖胺-LYTAC（Galac-LYTAC），它利用肝脏特异性溶酶体靶向受体Asialal糖蛋白受体（ASGPR）实现特异性降解，从而降低了脱靶效应的风险。
此外，LYTACs还面临着大分子生物特征优化的挑战。为了解决这一问题，研究者们正在探索基于适配体的LYTAC（Apt-LYTAC）的开发。最近，Wu等人成功开发出了首个Apt-LYTAC，为LYTACs的优化提供了新的思路。
它通过N-寡核苷酸适配子与ASGPR的三链N-乙酰半乳糖胺配体结合，从而有效诱导靶蛋白的降解。Apt-LYTACs不仅分子量低、化学稳定性高，而且合成简便高效，能够通过溶酶体降解途径介导膜蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）和细胞外蛋白血小板衍生生长因子（PDGF）的高效降解。Miao等人最近报道了一种双特异性适配体嵌合体，其机制与LYTAC相似，同样利用内体-溶酶体途径来介导蛋白质降解。
尽管LYTAC已被纳入TPD治疗策略，但作为治疗药物的应用还需进一步研究其在人体内的行为特征，如ADMET性质。然而，不可否认的是，LYTAC技术为选择性消除细胞外和膜相关蛋白提供了强有力的工具。
接下来，我们将探讨另一种降解技术——AbTACs。
2021年，Cotton等人首次报道了AbTAC，这是一种通过重组双特异性抗体将跨膜E3连接酶RNF43募集到细胞表面蛋白上的技术，从而诱导溶酶体降解。以PD-L1为例，研究人员利用与RNF43结合的Fab-噬菌体序列和PD-L1结合剂Atezolizumab产生了双特异性免疫球蛋白G（AC-1），证实了AC-1能够诱导多种类型细胞的PD-L1溶酶体降解。
与PROTAC主要介导细胞内蛋白降解不同，AbTAC突破了这一限制，为蛋白降解提供了新的思路。然而，其确切机制仍需进一步研究，特别是RNF43是否在内吞作用前泛素化靶蛋白的细胞内区域尚不明确。此外，AbTAC在人体内的形成可能降低免疫反应的风险，但在筛选最佳降解效率时，需综合考虑细胞特异性、内吞动力学以及RNF43的再循环等因素。
最后，我们将介绍另一种降解技术——GlueTACs。
这种技术利用特殊的分子结构将靶蛋白与溶酶体直接连接，从而实现高效降解。然而，其具体应用和机制仍有待进一步研究。
2021年，Zhang等人开创了一种新型的降解技术——GlueTAC。这种技术融合了共价纳米体与PROTAC策略的精髓，旨在实现高效且选择性的蛋白降解。GlueTAC主要由三部分巧妙构成：共价纳米体（GlueBody）、穿膜肽以及溶酶体分选序列（CPP-LSS）。通过GlueBody与细胞表面抗原的共价结合，GlueTAC能够特异性地将靶蛋白与溶酶体相连结，进而触发其高效降解。为了验证这一创新技术的实用性，Zhang等人将其应用于抗PD-L1纳米体的设计。该纳米体能够阻断PD-1与PD-L1的相互作用，从而恢复T细胞的杀伤能力。实验结果显示，GlueTAC技术确实能有效诱导细胞内PD-L1的内化和溶酶体降解，为肿瘤治疗提供了新的可能。
尽管GlueTAC技术显示出巨大的潜力，但仍然面临一些挑战。由于该技术利用非天然氨基酸增强与膜抗原的共价结合，这可能引发潜在的毒性问题。因此，在进一步推进GlueTAC技术的临床应用之前，必须对其安全性进行全面评估。此外，GlueTAC的血清半衰期和肾脏清除率等关键参数也需要深入考察，以确保其在人体内的行为特征符合预期。
除了传统的内体-溶酶体途径，近年来还涌现出一种新的降解策略，即利用自噬-溶酶体途径来消除致病蛋白。
这一策略包括AUTACs、ATTEC、AUTOTACs以及基于CMA的降解物等技术。其中，AUTACs技术备受瞩目。
AUTAC分子巧妙地结合了细胞内靶蛋白的特异性结合剂与一个标签组。这个标签组通过模拟S-鸟嘌呤基化，诱导靶蛋白发生k63-多泛素化。泛素化的靶蛋白随后被自噬受体识别，进而启动选择性自噬降解的过程。
Takahashi等人于2019年率先报道了AUTACs的应用。他们设计的首个AUTAC分子AUTAC1，以烟曲霉素为基石，靶向蛋氨酸氨基肽酶2（MetAP2），成功降低了HeLa细胞中内源性MetAP2的水平。此后，他们进一步利用合成的FKBP配体SLF与FKBP12结合，制备出AUTAC2用于降解fk506结合蛋白FKBP12，取得了显著效果。
此外，还设计了AUTAC3，利用JQ1作为配体靶向转录调节因子BRD4。虽然AUTAC3仅能轻微降低A549细胞中BRD4的蛋白含量，但它为后续研究提供了新的思路。
最近，他们又开发了一种名为AUTAC4的线粒体靶向降解物。该降解物通过2-苯基吲哚衍生物精准地靶向线粒体，并借助FBnG单元作为降解标签。实验证明，AUTAC4能有效减少小线粒体和受损线粒体的数量，减轻羰基氰化间氯苯腙诱导的线粒体凋亡和膜电位丧失，同时维持细胞内ATP水平。更重要的是，它还能促进线粒体自噬，为急性线粒体损伤细胞的救治提供了新的希望。
鉴于线粒体功能障碍与多种年龄相关疾病紧密相关，如糖尿病、癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等，AUTAC4以及其他潜在的基于自噬的线粒体降解物，无疑为这些疾病的治疗带来了新的曙光。
图4展示了自噬-溶酶体途径降解技术的示意图。AUTAC作为一种创新的TDP策略，率先运用了自噬机制，能够降解细胞质蛋白及与疾病相关的线粒体碎片。这一发现为自噬药物的开发提供了新思路。相较于基于UPS的降解系统，AUTAC在特定性和广泛性方面展现出了独特优势。但值得注意的是，其作用机制涉及多个复杂步骤，且对全细胞蛋白质含量的安全性和有效性尚需进一步探索。因此，未来研究将聚焦于探究AUTAC分子对选择性自噬过程的影响及其在体内的实际效用。
此外，ATTEC也是一种值得关注的降解技术。它通过直接与自噬受体微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）结合，触发致病蛋白的自噬降解。据Li等人研究，ATTEC化合物能够连接LC3和突变型亨氏蛋白(mHTT)，从而降解导致亨廷顿氏病（HD）的mHTT。这一发现为亨廷顿氏病的治疗带来了希望，同时也展示了ATTEC平台在降解其他致病蛋白方面的潜力。
通过与自噬受体LC3的直接结合，并绕过泛素化过程，ATTEC展示了降解不同类型底物，如胞质蛋白、受损细胞器以及DNA/RNA分子的潜力。为了进一步挖掘ATTEC的潜力，Fu等人创新地提出了脂滴-ATTEC（LD-ATTEC）策略。这一策略利用自噬受体LC3与LDs的连接，实现细胞和小鼠模型中LDs的几乎完全清除，从而减少与LDs相关的表型。LDs，作为细胞内的关键细胞器，在能量储存和脂质释放中扮演着核心角色。其积累与多种疾病紧密相关，包括动脉粥样硬化、肥胖、炎症性疾病、Ⅱ型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病以及癌症等。因此，LDs的特异性降解可能为这些疾病的治疗提供全新的策略。
此外，ATTEC还为非蛋白细胞组分的降解提供了新的可能。其低分子量、直接靶向降解机制以及广泛的目标谱等特点，使其在未来具有广阔的应用前景。
另一方面，现有研究揭示了自噬受体p62在清除错误折叠蛋白中的关键作用。p62不仅具有泛素结合域，还与LC3相互作用区（LIR），这使得它能够作为桥梁分子同时识别蛋白载体上的泛素链和自噬体膜上的LC3，进而诱导自噬体的生成。基于这一发现，Kwon等人设计了AUTOTAC平台。这一平台利用p62依赖性自噬系统，通过双功能分子将靶结合配体（TBLs）与自噬靶向配体（ATLs）结合，激活p62并诱导其自聚合。AUTOTAC分子能够同时识别自噬受体p62和靶蛋白，进而触发自噬体的生成和靶蛋白的降解。这一策略为自噬技术在药物开发中的应用提供了新的思路。
基于这一策略，科研人员设计并合成了一系列激活p62的小分子化合物，并在实验中验证了它们对多种可溶性蛋白的降解效果。例如，以PHTPP（雌激素受体β的非甕体合成配体）为基础设计的AUTOTAC（PHTTP-1304）能够特异性地靶向Erβ，并成功诱导了多种癌细胞中p62的自寡聚和ERβ的降解。同样，针对MetAP2和雄激素受体的AUTOTAC也显示出了显著的自聚合和靶蛋白降解效果。此外，AUTOTAC PBA-1105还能有效诱导P301L突变体tau的自噬降解，这为神经原纤维缠结的形成以及随后的突触功能障碍和神经元死亡提供了新的研究视角。
AUTOTAC平台为细胞内蛋白质的选择性和高效降解提供了可能。其核心机制在于通过p62与LC3的直接结合来触发降解过程，无需依赖特定的连接物长度或靶蛋白的泛素化。尽管如此，在将AUTOTAC平台应用于临床实践之前，仍有必要深入探讨其组织特异性及潜在脱靶效应。
接下来，我们将介绍另一种重要的蛋白质降解模式——伴侣介导的自噬（CMA）。
CMA是一种基于溶酶体降解途径的细胞内蛋白质选择性清除机制。在此过程中，分子伴侣Hsc70c能够识别底物蛋白中存在的KFERQ样基序，并将其引导至溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）。LAMP2A作为一种受体，能够识别并转运含有KFERQ基序五肽的胞质蛋白至溶酶体膜上。随后，这些底物蛋白通过LAMP2A多聚体复合物进入溶酶体进行降解。值得注意的是，基于CMA的降解分子设计通常包含细胞膜肽、CMA靶向基序（CTM）以及靶蛋白结合域（PBD）等关键元件。
Fan等人成功合成了一种包含CTM-PBD穿透肽TAT47-57的嵌合多肽，该多肽能以可逆且剂量依赖的方式显著降低多种蛋白质水平，例如PSD-死亡相关蛋白激酶（DAPK1）以及α-突触核蛋白（SNCA）。Zhou等人则设计了一种膜渗透肽（DAT-CDK5-CTM），该肽能有效阻断CDK5与N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基2B(NR2B)的相互作用，进而在小鼠缺血性卒中模型中促进CDK5的降解。值得一提的是，CMA策略同样适用于mHTT蛋白的靶向降解。
基于CMA的降解策略是一种以内源性蛋白质为靶点的新型肽类降解方法，它为当前的TPD治疗提供了有力的补充，并有望推动疾病治疗领域的发展。然而，目前我们对CMA的调控机制仍知之甚少。由于CMA降解剂主要是肽类化合物，其稳定性和递送效率成为亟待解决的问题。因此，这一领域仍需深入的研究和探索。
表2 各种TPD策略的优点与局限性概览
在探索疾病治疗的新途径中，靶向蛋白质降解（TPD）策略日益受到关注。然而，每种策略都有其独特的优点和局限性。为了更全面地了解这些策略，我们整理了各种TPD方法的优劣势，以期为未来的研究提供有益的参考。
tTPD 系统
不同于在野生型基因组背景下工作的TPD降解剂，如PROTACs，tTPD系统是一种创新技术，它要求在POI上添加特定标记，例如氨基酸信号序列。这些标记化合物能通过靶向降解剂促进POI的降解。tTPD系统利用UPS（泛素-蛋白酶体系统）诱导POI的快速、选择性和可逆降解。该系统涵盖了多种技术，包括降解结构域（DD）、生长素诱导degron（AID）、HaloPROTACs、dTAG系统、IKAROS家族锌指3（IKZF3）肽degron、配体诱导亲和蛋白导弹（L-AdPROM）、BromoTag以及靶向nanoluc的PROTACs（NanoTACs）。
尽管为潜在目标开发定制TPD对许多学术实验室而言成本高昂且结果难以预料，但结合TPD技术与基因改造，消除对特定配体的依赖仍具有显著的吸引力。
图5 tTPD系统示意图
随着tTPD技术的持续进步，其在药物研发领域展现出巨大的潜力。这一技术有望在识别创新性治疗靶点以及靶点的有效验证中发挥关键作用。
小结
TPD技术，特别是PROTACs，在药物研发领域展现出显著优势，已从临床前研究迈向临床试验。然而，尽管PROTACs通过UPS有效清除细胞内蛋白，但溶酶体介导的TPD策略，如LYTACs和AbTACs，在降解细胞外和膜蛋白方面更显优势，标志着TPD发展的一大飞跃。尽管如此，这些策略仍面临高分子量、linker长度研究不足及药代动力学挑战。同时，新技术如Apt-LYTAC、ATTEC、AUTOTAC等的涌现，为蛋白降解模式创新提供了更多选择。TPD技术的优越选择性和高效性，使其成为靶向降解的理想选择，在癌症、慢性病等多种疾病治疗中展现出广阔前景。同时，它也可作为一种通用策略，用于评估体外和体内目标蛋白的药物开发潜力。尽管如此，克服现有TPD方法的局限性仍需进一步探索。总体而言，TPD技术未来可期，将为药物开发带来更多可能。
