凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法，其理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右(12%~19%)，因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即：蛋白质含量 = 含氮量/16%。

凯氏定氮法测定粗蛋白含量的操作步骤

1. 样品处理

· 固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2~1.0mg范围内。

· 例如，在测定食品中蛋白质含量时，精密称取0.2 2.0g固体样品或2 5g半固体样品或吸取10 20ml液体样品(约相当氮30~40mg)，移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。

2. 消化

· 硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。

3. 蒸馏

· 将微量凯氏蒸馏装置洗涤(先用水蒸气洗涤)干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。

· 吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30%氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。

· 取一三角瓶，加入10ml硼酸 田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。

· 加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子，凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸指示剂混合液，吸收蒸馏出的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸12min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。

4. 滴定

· 样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01M标准盐酸滴定，至硼酸 指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。

凯氏定氮法测定粗蛋白含量的计算

· 根据硫酸或盐酸溶液消耗的体积，计算总氮含量，再乘以蛋白质系数(乳及乳制品换算系数为6.38，一般情况下为6.25)，即为粗蛋白的含量。例如，样品总氮量(mg)=(A
B)×c×14×100/20(式中：A为样品滴定时消耗的标准盐酸体积，B为空白滴定时消耗的盐酸体积，c为标准盐酸的当量浓度，14为氮的相对分子量，20为用于蒸馏的稀释消化液体积，100为稀释消化液的体积)，样品中粗蛋白含量(mg)=样品总氮量(mg)×6.25。

注意事项

· 试剂的配制：所用试剂应使用无氨蒸馏水配制，以避免引入误差。

· 样品的制备：样品应充分粉碎并过筛，以确保取样的代表性。在称量样品时，应避免样品粘附在瓶壁上，以防氮的损失。

· 消化过程：消化过程中需保持适当的温度和时间，以确保样品完全消化。同时，要不断搅拌样品，以防其粘附在瓶壁上。

· 蒸馏过程：蒸馏过程中应保持蒸汽充足且均匀，以防发生倒吸现象。要注意观察冷凝管下端是否插入硼酸吸收液液面以下，以防氨的逸出。

· 滴定过程：滴定过程中应注意滴定液的浓度和滴定速度，以防误差的产生。

应用与优势

1. 应用

· 凯氏定氮法广泛应用于食品、饲料、农业等领域。在食品工业中，该方法可用于检测乳制品、肉制品、豆制品等各类食品中的蛋白质含量，以确保产品质量和安全。在饲料工业中，该方法可用于评估饲料原料和配合饲料中的蛋白质含量，为饲料配方提供依据。此外，该方法还可应用于土壤、水质等环境样品中蛋白质含量的测定。

2. 优势

· 准确性：凯氏定氮法能够准确测定样品中的含氮量，进而推算出粗蛋白含量。

· 效率：现代凯氏定氮仪通常配备自动化功能，如自动加水、自动加酸、自动蒸馏等，大大提高了实验效率。

· 可重复性：凯氏定氮法的标准化操作流程确保了实验结果的可重复性。

· 适用性广：适用于各种类型样品(如饲料原料和成品)的粗蛋白含量测定。