CCK-8是操作更简单、数据更稳定、灵敏度也较高的细胞增殖与毒性检测方法。CCK-8实验过程简单总结为配置细胞悬液、加入待测物质、待测物质与细胞共同孵育一定时间、加入CCK-8、测定吸光度五步。但其中仍有需要注意的地方，值得探讨学习。

CCK- 8全称为Cell Counting Kit-8，试剂中含有WST-8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯( 1-Methoxy PMS )的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物( Formazan )。生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

优点：

1. 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；

2. 检测快速；

3. 灵敏度高，优于WST-1；

4. 重复性优于MTT；

5. 对细胞毒性小；

6. 试剂稳定性很好，优于WST-1；

7. 为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

缺点：

1. 与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵；

2. CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

CCK-8 检测细胞活性原理图

一、CCK-8 注意事项

1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
关于胰腺癌的细胞量摸索，如果细胞状态好的话，一般1500就可以了。有些长得慢的细胞，可以加到2000。长得慢的细胞建议最高建议不要超过5000细胞量，太多到第三四天贴壁的时候，会出现分光度值OD反倒下降的情况。
关于CCK-8试剂 一开始分光度值一致很难一致，如果做了很多次，确保种细胞量是一致的，但是还是数值相差较大，可能和细胞贴壁能力有关。
2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。初学者建议做多几个复孔，后续在处理数据的时候，可以剔除
细胞悬液如何混匀，建议以1ML枪头反复轻轻吹打，至少30下，并在种板的过程种边种边吹。尤其到细胞种板的后面，吹打一定要到位。不可省略。
3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基或PBS。
全板的四周所有孔建议留白，可加PBS/培养基均可。建议第2-3天便更换培养基，加培养基的时候，预防污染，可以先分装50ML离心管，然后再换液，换液完之后，剩下的液体丢弃。
4. 建议采用多通道移液器（这个我们暂时没有，因为穷），减少平行孔间的误差，加 CCK-8 时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰 OD 值。并建议用100ML枪头加10u培养基，预防枪头太短，而贴离心管壁造成污染。

5.若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。

6.CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。

7. 可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较 （只加 CCK-8 试剂），如果 OD 值明显偏高，则说明有反应。
9. 加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。

10. CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定，建议刚拿到CCK-8 之后可用EP管分装，一来预防反复冻融，二来，预防各种污染。

二、CCK-8常见问题及解决办法

1、一个孔中应接种多少个细胞？

当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

2、CCK-8溶液对细胞的毒性大小如何？

CCK-8溶液对细胞的毒性非常低，通常观察不到细胞毒性。细胞在CCK-8法检测后仍然可以正常生长，并可以用于其它的细胞实验。但为了避免CCK-8溶液可能带来的对于后续检测的影响，除非该细胞极难获得，否则不推荐把CCK-8溶液孵育过的细胞用于其它实验。

3、酚红会影响检测吗？

不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

4、CCK-8能否检测细菌细胞？

可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。

5、如果没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？

还可使用430 nm到490 nm之间的滤光片。但450 nm是最准确的。

6、如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？

可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

7、CCK-8的保存和稳定性如何？

CCK-8稳定性高，避光条件 -20℃ 有效期 2 年，4℃ 有效期 1 年。经常使用建议 4℃ 保存，避免反复冻融。CCK-8正常颜色为粉红色，若颜色发生明显偏差，质量可能有发生变化。

8、CCK-8会对活细胞进行染色吗？

不会，首先 WST-8 不会进入细胞染色，整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外WST-8 甲臜都属于高度水溶性组分，反应结束更换新的培养液，即可清除外源组分。

9、在加入 CCK-8 时可否不更换培养基？

一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。

10、若是使用 6 孔或者 24 孔板进行试验，CCK 试剂使用量怎么样呢？

如果要使用 6 孔板或 24 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK 溶液。

11、能否用 384 孔板进行细胞增殖与活性检测的实验呢？

可以，CCK-8 产品的使用量为每孔培养基总体积的 10%。建议先将 CCK-8 产品稀释一倍，然后加入培养基总体积的 20% 即可，这样可减少误差。

12、若是暂不检测 OD 值，该如何处理？

若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL 0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化

13、在实验中 OD 值太高，怎么解决？

可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。

14、如果 OD 值太低，怎么解决？

一般会采取这两个方法：

1、适当增加细胞数量；

2、延长加入 CCK-8 试剂后的反应时间。

15、每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

可能会有以下几个原因：

①当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。

②有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。

③每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔 范围内摸索条件。

16、如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

17、哪些物质会影响CCK-8的测定？

当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

18、说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CC K-8试剂？

一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。

19、必须预培养细胞吗？

不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

20、如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？

金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm，将会100%抑制。

21、CCK-8试剂的保存条件？

在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存，分批使用建议分装保存。

22、CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

23、有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。

24、实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？

需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。