图1.abi4突变体显示了ABA应用对主根生长抑制的ABA不敏感表型。A，将在1/2MS培养基上发芽的3日龄幼苗转移到1/2MS培养基或ABA培养基上，转移2天后收获幼苗拍照。B，三种基因型(A)的主根长度统计。C，将在1/2MS培养基上发芽的4日龄幼苗转移到1/2MS培养基或ABA培养基上，转移2天后收获幼苗进行拍照。D，3种基因型(C)的主根长度统计。先前描述的点突变abi4-1 (CS8104)和T-DNA插入突变abi4-t(SALK_080095)被用于该实验。数值为平均数±SE。每个试验至少重复3次，每重复1次，每个基因型用>30根。星号表示差异显著(*P<0.05，**P<0.01)，根据t检验分析。ABA浓度为30μM，Bar=1cm。

图2.ABA处理后abi4突变体分生组织大小增加。abi4和abi4-t幼苗在1/2MS培养基或1/2MS+ABA培养基上分生组织细胞大小和细胞数量的表型分析在1/2MS培养基上收获4日龄幼苗。将1/2MS培养基上3d龄的幼苗转移到不同ABA浓度的含ABA培养基中，转移2天后收集幼苗进行分析。A-C，幼苗在1/2MS培养基上的分生组织细胞大小。D-F，幼苗在含ABA培养基(15mM)上的分生组织细胞大小。Bar=50μm。检查了大约5-10张图像，并进行了至少3次独立实验。采用t检验分析评估差异的统计学显著性。星号表示与对照(CK)在0-h(*P<0.05)有统计学显著性差异。数值为平均值±SE。

qPCR分析显示，CYCB1;1、CYCD1;1、CYCD3;1、CYCD3;2、CYCD5;1、CDKA;1、CDKB2;2 等大部分阳性调控基因的表达水平均显著高于WT。CYCD2;1、CDKB1;1 mRNA丰度值仍高于WT。与WT根尖相比，abi4突变体的初代根尖中CYCD3;3和CDKB2;1的转录水平没有改变甚至降低。这一发现表明，转录因子ABI4在调控ABA介导主根生长方面，对这些基因的表达可能只有微弱的作用或没有作用。此外，我们还发现外源ABA处理仍然可以诱导abi4根中关键细胞周期基因的表达，但变化较小，这表明除了ABI4外，还有其他因素参与ABA介导的细胞周期基因转录。采用了染色质免疫沉淀(ChIP)-seq法，研究ABI4是否直接控制与细胞周期相关基因的转录，结果表明，ABI4可以结合数千个已知基因的启动子，并且大多数结合位点位于转录起始位点上游0-3000-bp处(图3A)，数十个潜在的abi4调控基因与细胞周期过程密切相关。值得注意的是，在CYCB1;1启动子中检测到9个CCAC基序(图3B)，在CDKB2;2启动子中检测到1个CCAC基序(图3C)，这表明ABI4与这些启动子之间可能存在直接相互作用。随后，对我们之前研究中获得的ABI4转基因植株进行ChIP-qPCR检测，由于ABI4与其启动子片段直接相互作用，因此选择ABI5启动子元件作为阳性对照。对两个独立的OE-ABI4转基因株系进行ChIP-qPCR分析，结果相似。如图3、D和E所示，我们使用抗绿色荧光蛋白(GFP)抗体，确定CYCB1;1和CDKB2;2的启动子相对于染色质免疫沉淀的DNA是富集的。尤其是P3和P5(用于CYCB1;1)和P6(用于CDKB2;2)片段(图3、D和E)。正如预期的那样，随后的酵母单杂交实验证实ABI4直接结合到CYCB1;1和CDKB2;2基因的启动子上(图3F)。以呼吸爆发氧化酶同源物D(RbohD)启动子片段作为阳性对照。重要的是，突变的CDKB2;2启动子片段，其中CCAC被改变为CCAA，不直接与ABI4转录因子相互作用(图4F)。总之，ChIP-qPCR和酵母单杂交实验都表明，ABI4确实直接与CYCB1;1和CDKB2;2的启动子物理结合。

结合基因表达分析和生化证据(图3)，随后选择烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达系统，在体内探索ABI4是否抑制CYCB1;1和CDKB2;2的转录。为此，报告质粒Pro-CYCB1、1-GUS和Pro-CDKB2、2-GUS和pCanG-ABI4-GFP质粒分别在N. benthamiana叶片中短暂共表达。如图4所示，当Pro-CYCB1;1-GUS或Pro-CDKB2;2-GUS构建体与pCanG-HA-GFP结合时，检测到强烈的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)表达，以染色方式显示(图4,G和H);然而，当pCanG-HA-GFP控制载体被等量的效应物pCanG-ABI4-GFP取代时，GUS染色明显减少(图3,G和H)。GUS活性量化的结果也证实了ABI4对体内CYCB1;1和CDKB2;2表达的抑制作用。这些结果表明，ABI4确实通过直接与各自的启动子相互作用来抑制CYCB1;1和CDKB2;2的转录。

图3.ABI4通过直接结合CYCB1;1和CDKB2;2的启动子来促进其转录。A, ChIP-seq结果总结。饼状图显示了ABI4与启动子片段结合的位置。B和C，启动子序列分析(B) CYCB1;1和(C) CDKB2;2；在CYCB1;1的ATG上游1197bp的片段和CDKB2;2的起始密码子上游609bp的片段分别被确定为它们的启动子。D和E，通过ChIP-qPCR检测ABI4转录因子与(D) CYCB1;1和(E) CDKB2;2启动子之间的关系。从转基因植物OE-ABI4中分离出染色质。选择ABI5的启动子片段作为阳性对照，ACTIN12的启动子区域作为内对照。星号表示差异显著(**P<0.01)。数值为平均值±SE, n=4。采用t检验进行统计学分析。F，酵母单杂交试验显示ABI4与CYCB1;1和CDKB2;2启动子之间的直接相互作用。本实验使用全长启动子。选取RbohD的启动子区域作为阳性对照。此外，CDK2;2启动子发生突变，然后进行酵母单杂交分析。G和H，Nicotiana benthamiana瞬时表达实验显示，ABI4在体内抑制(G) CYCB1;1和(H)CDKB2;2的表达。N. benthamiana叶片的代表性图像。

为了进一步探讨ABA处理下ABI4对生长素生物合成的影响，我们随后检测了生长素生物合成基因的转录模式。结果显示，在WT背景下，外源ABA施用显著下调了YUCCA2和YUCCA8这两个负责生长素生物合成的关键基因的表达水平(图5,A和B)。ABA处理后，YUCCA2和YUCCA8的转录水平与在1/2MS培养基上生长的幼苗相似(图5,A和B)， ABI3和ABI5对YUCCA2和YUCCA8表达的影响较弱。总的来说，在ABA处理后，abi4主根中YUCCA2和YUCCA8的表达水平高于WT，这进一步表明在外源ABA存在的情况下，abi4主根中生长素的含量可能高于WT。

为了验证上述假设，我们接下来检测了外源ABA处理或不处理的abi4主根尖的内源生长素浓度，即吲哚-3-乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)。结果表明，ABA处理后，abi4主根尖的IAA和IBA浓度显著高于WT，而在1/2MS培养基上，abi4与WT系之间的生长素浓度相似(图5,C和D)。我们进一步证明，外源IAA处理可以在很大程度上恢复外源ABA存在下OE-ABI4植株受抑制的主根生长表型(图6,A-C)，这证实了ABA处理下OE-ABI4根系变短的表型至少部分是由生长素浓度降低引起的。为了更好地了解生长素浓度在abi4主根尖响应下的变化规律，在外源ABA处理下，我们探索了不同条件下PIN1 (PIN-FORMED1)的转录水平，这是一个编码生长素外排转运体的关键基因。使用报告基因结构PIN1_promoter::PIN1-GFP监测PIN1的表达，该结构与abi4突变体背景交叉。结果显示，外源ABA处理后，PIN1_promoter::PIN1-GFP在abi4主根尖的表达量显著高于WT处理。在外源ABA处理下，与WT相比，abi4主根尖生长素浓度的上调是其根长增加的原因。

图4.DR5_promoter-GFP在WT和abi4突变根中的表达模式。A-D，在1/2MS培养基(A和B)和含ABA培养基(C和D)上生长的两种基因型中DR5_promoter-GFP报告基因的表达模式。E (A)-(D) GFP荧光水平的统计分析。取生长在1/2MS培养基上的4日龄幼苗进行取样。将1/2MS培养基上3d龄的幼苗转移到含有ABA培养基(30μM ABA)上，在转移2天后收获幼苗进行分析。Bar=50mm。每个基因型检查5-10张图像，至少进行3次独立实验。采用t检验分析评估差异的统计学显著性。值为平均值±SE。*表示与对照(CK)有统计学显著差异，0-h点(*P<0.05)。

图6.外源生长素的施用在很大程度上恢复了ABA处理下OE-ABI4的主根生长抑制表型。A, WT和OE-ABI4系在1/2MS培养基上加或不加ABA (3μM)或NAA(1-萘乙酸，1nM)处理的主根表型。将1/2MS培养基上4d龄的幼苗转移到添加或不添加ABA或NAA的培养基上，在转移后1.5d收获幼苗。Bar=10mm。B，(A)主根长度的定量分析。*表示经t检验，在**P<0.01水平上差异显著。数值为平均值±SE，一次实验至少重复三次，每次重复每个基因型n>30。C、(B)中各处理下OE-ABI4与WT的比值。按(B)中的平均值计算。