今天很高兴给大家分享一下我在基因治疗领域的一些想法。我想跟大家分享我自己在AAV基因治疗中的一些体验，那就是我觉得AAV是需要内外双修的，因此我今天的讲题主要集中在AAV作为基因治疗的载体，在递送基因这方面我们有哪些工作需要做。

归结起来一句话：AAV是一个高价值的房地产，它的每一分土地都要争，每一个碱基对未来基因治疗药物的发展都非常重要。所以我希望给大家分享，我们是怎样做AAV的基因工程，怎样从概念验证到临床研究，再到临床转化的。

基因治疗主要是两种方法，一个是In vivo，这种情况下基因治疗的药物像其他的药物一样，直接打到人体内发挥基因的作用；另外一种叫Ex vivo，这种情况下把人的细胞取出来进行基因改造、扩增再打回体内，这样打进去的细胞就成了活的药物。

从中国的第一款基因治疗药物今又生到现在，整整20年过去了，在这20年当中共45个基因治疗的产品被各个国家的监管机构批准，在这四十多个产品中有15个是我刚才讲的Ex vivo，有30个In vivo。从递送平台来讲有17个是Non-viral，有28个是viral。特别重要的是，最近几年我们有8个AAV基因治疗的产品被批准。

AAV的特点是什么？总结起来有四点：第一，它的效率高；第二，安全；第三，持久性；第四，可以调控。

AAV最大的优势是持久性，但是持续时间也会受各种因素的影响。小结一下，一种来自非免疫，这种情况主要与target细胞和非target细胞的半衰期、表观遗传、细胞应激，还有其他的因素特别是患者的生活方式、是否饮酒、是否有体力劳动有关；另外一种是来自免疫性的，包括先天性免疫、适应性反应，也包括旁观者效应。

基因治疗除刚才小结的这些方面，因为AAV不是插入性的，还要考虑人接受基因治疗的细胞的持久性，我给大家整理了各类细胞的耐久性——感光细胞是最久的，第二神经元，第三神经胶质细胞，第四肌细胞，最后是肝细胞。

从下面可以看到它们的半衰期，这些明确提供了发展基因治疗药物上的想法。因为这个原因大家可以看一下，目前13种疾病的基因治疗的发展过程中，各类药物的发展现状是不一样的，第一张图是公司数量，第二个是药物研发管线，第三个是在进行临床试验的药物，第四个是被监管机构批准的药物。

大家可以明显看到一个结论：中枢神经是最热门的靶点。

我刚才讲了AAV是一个内外双修的好东西，第一它的外表很重要，穿什么衣服决定它是一个什么性格的人，所以它是递送的主要工具。我从事AAV的研究是在九几年开始的，当时我加入了我的博士后导师James Wilson的实验室，那个时候我们就开始希望用分子生物学的方法分离更多的AAV。

这个方法产生后，我们挖到一个“金矿”，当时分离了100多种AAV，其中大家最熟悉的就是AAV9。这是当时的实验记录本，这是当时用PCR分离的AAV9。AAV9最大的功能就是可以穿透血脑屏障或者递送到全身的组织中。

我2008年到麻省大学后，在Flotte院长领导下我们继续做自然AAV的发现。我们在2020年发表了一篇文章，这是AAV2的衍生体，它转染效率比AAV2高13倍。我们现在分离了很多其他的AAV，也属于AAV2的衍生体，转染效率达到或者远远超过了AAV9。

我今天的演讲主要是聚焦在内修。内修什么意思？我们的载体基因组是基因递送药物的重中之重，这个药物的每个碱基对都非常重要，我们要寸土必争。

尤其是下一代基因治疗药物，一定是调控的药物，而不是越多越好。所以怎样调控基因表达成为我们今后主要的挑战。

现在讲到基因组，必然要提到基因治疗的方法，一个方法是基因替代，第二个是基因沉默——这主要指当出现功能或毒性增强的时候，需要把毒性基因沉默掉。

今天我用三个例子，从基因组设计、从药物设计的角度向大家介绍，需要注意什么事情。

这是谢军教授和他的博士后团队——谢清和陈秀鹏。

我们当时瞄准的是基因治疗药物Zolgensma。Zolgensma的机制是基因替代，目前已经给约3500位病人进行了注射。它是一个非常有效的药物，但有一个缺点是存在肝毒性。

当时谢教授和团队就在想，怎样能够降低毒性——其中一个想法就是把活性提高。他们设计了7种不同的载体来比较，确实把载体的活性和基因表达的活性都提高了。

他认为，活性提高以后，如果降低剂量可能会更有效更安全。他就选择了两个，一个是用Zolgensma作为基准，另一个则是表达最好的。

第一个我们发现，Zolgensma在90天内能延长小鼠的生命的比例只有大概百分之十几到二十几。而这篇论文被Nature Biotech撤稿也就是这个原因，这也意味着实际上Zolgensma在人体成功翻译可以说是个奇迹。但是如果把更强的载体打进去，结果发现老鼠死得更快。只有低剂量的状态下，才会跟原本的Zolgensma差不多。

从这里面我们得到的结论是，Zolgensma或者高表达会造成毒性。

那这个毒性的原因是什么呢？我们发现小鼠打到第8天后出现黄疸，肝脏里出现病理变化、渗入和细胞死亡，我们仔细看它的肝功特别差，表达水平超过正常生理水平。结论是基准载体会导致肝损伤，增强的SMN1表达会使情况更差。

怎么解决这个问题呢？首先我们要证明它确实是肝毒性，我们来看从载体基因组设计的角度怎么做这个事情。

我们知道miRBS很短只有24个碱基对，如果载体到了没有表达miRBS的地方，它就会表达transgene；但如果到了表达miRBS的地方，就会被杀掉，然后transgene没有表达，这应该是一个非常有效的方法来实现组织专一性。

于是，我们把miRBS加到Zolgensma和载体中，发现可以消除肝毒性，动物会正常生长，这就证明肝脏毒性是让Zolgensma增强表达的主要原因。

然后我们来解决下一个问题，知道是肝脏毒性后，我们怎么解决这个肝脏毒性，除了用miRBS之外有没有其他方法。

我们过去的递送经验非常重要，可以实现组织特异性，也可以实现细胞特异性。我们想，能不能把基因表达做成基因特异性？

所以谢教授设计了一个载体，这个载体是用SMN自己的启动子表达，这样表达水平很高，而且从疗效的角度讲远远超过BMK，可以实现80%-100%的存活。而且生长曲线也可以看到明显的区别，除此之外通过翻正反应测试、网格悬挂测试还可以看到，运动功能在早期有明显的改善。

小结一下，我们把这个产品叫做第二代Zolgensma，我们实现了延长生命周期、消除肝毒性、提高运动功能等需求。另外，Zolgensma会引起小鼠的心脏毒性，所以我们也提高了心脏功能，使得周边组织也实现了基因表达的专一化。

这是用基因特异性启动子的第一个应用，但是谢教授在他第二个项目给博士后Fang Wang做研究时想到，既然SMN1是一个运动神经元的基因，我们可不可以用它来做基因沉默？

所以他们设计了基因沉默的构建，用两个miRNA scaffold来进行沉默，然后用SMN1的启动子来调控。大家可以看到，他们可以在存活率很低的模型里面实现了104天的寿命延长。

而且如果在家族性ALS发病前针对SOD1这个基因进行沉默，可以延缓疾病发作62天，这些是非常关键的数据。如果我们仔细看它的表达——这是SOD1的表达，在PBS的情况下它的表达水平很高，如果进行基因沉默则会降低，最底下是野生型。而且在全身各个组织都能非常有效地沉默SOD1的表达，按照启动子的强度和生理分布来实现这个目标。

最重要的是它有表型矫正，用体积描记法（Plethysmography）测量呼吸功能，大家可以看到用药后这些动物的呼吸功能有明显改善。呼吸功能的丧失是ALS最痛苦的事情，所以我们希望这个药物能够继续做下去，对病人有所帮助。

我们继续问下一个问题，上述情况是在发病前给药，但如果到90天时疾病已经开始，或者到120-125天时疾病已经到了很严重的晚期，我们还能延长这些小鼠的生命吗？结果是很明显的，依旧可以延长生命，而且打药后体重维持平衡，而没有打药的动物会慢慢停止生长，出现各种各样的问题。

重要的是这些基因沉默后，会不会影响内源性小RNA的表达谱。

第一个问题，我们用AAV表达非常高的复制数量，实际上只占到内源性RNA的不到0.1%，所以对内源谱没有表达。另外是Guide strand和Passenger strand的比率，Guide strand是在RNA沉默中起作用的分子，97%都是Guide strand，很小一部分是其他的，miRNA的加工非常重要，96%都是按照预期方式进行加工。

现在与基准比一下，这些是过去已经发表过的用AAV或者ASO在不同的时间给药延长生命的时间。但是我们现在这个分子，它延长生命的效果远远甩其他分子几十条街，这是非常重要的突破。

小结起来，从给药预防或者在早期治疗，我们的药物可以打满分，后期治疗我们的药物也能够延长生命。

刚才讲了用启动子，下面给大家分享的是只改变ITR的案例。

大家不要小看这个ITR，给大家看一个数据，我们分离了两个新型AAV：AAV8和AAVrh.39，其他都一样，只嵌进ITR，大家看结果，我们可以提高25倍的表达。

这说明AAV的每寸土地每个碱基对都有它的作用。我觉得目前我们对AAV理解的太少，这给大家一个启示。

我们问下一个问题，ITR里究竟哪个部分起作用，为什么会这么有效？

我们发现了一个新的元件，叫做ITR-proximal region，就是IPR，它是100个到120个碱基对左右，它加到里面有什么作用？我们先看In vitro，对比PGK启动子和只放IPR的表达，大家可以看到在细胞里IPR高于PGK启动子4倍，增强效果是非常强的。然后用AAV2的IPR或者AAV8的IPR、AAVrh.39的IPR，加或者不加各自的IPR打到肌肉里，大家可以看到没有IPR和加了IPR的结果对比，加了IPR能看到显著增强了转导。

最后给大家分享我自己的经历。

我在1989年进入罕见病研究，我的博士论文课题是Canavan病的基因替代疗法，这个病是Canavan博士1931年在麻省总医院发现的，这个病不仅在阿什肯纳兹犹太人中比较普遍，而且在普通人口中发病率约1:300。

这个疾病的典型特征是脑白质营养不良，病人一般只能存活到5岁左右，最重要的生物标志物是NAA，只要尿液里有NAA，一定是Canavan病。这是2013年我在奥兰多开一个Canavan会议，和十几个孩子们照的照片，但是2016年我回去开同样的会议，就只有几个孩子存活，每次看到这张照片我心里都很难受，这推动我和我的团队尽快研发药物。

这个疾病主要的问题是脑白质的海绵状变性，大家看到的这个像瑞士奶酪一样的结构，是脑白质空洞性病变造成的。我的导师Matalon博士，最早发现了Canavan病的生物化学缺陷，问题出在哪个地方呢？NAA在神经元里产生，运送到少突胶质细胞进行加工，加工主要用到的酶叫天门冬氨酸酰化酶，然后降解释放出乙酸和其他成分，给髓鞘形成提供一些材料。但是如果有这个基因突变，NAA就没办法加工，造成一系列问题。

我在1989年开始做这个病的研究，1993年在Nature Genetics发表我的博士论文，发现了基因和致病突变，这就使基因治疗成为可能。

我们在宾大的工作发现了AAV9可以穿透血脑屏障，我的同事、临床科学家Gessler博士开始修饰这个基因，做了密码子优化，打到动物里去发现它对基因表达提高了整整5倍，而且对降低NAA非常有效，比原来降低效率高10倍。

但要我要提醒大家，密码子优化是个双刃剑。我们在密码子优化这个过程中要考虑两个问题，它虽然会增强表达，但会影响到CpG motif。所以在基因治疗载体设计过程中，一定要达到两者的平衡，既要有高表达，同时不能过于增加CpG motif。

这个问题怎么解决，说起来容易其实并不简单。大家知道我们开始做基因治疗都送到外面公司去帮你做密码子优化。我们希望知道任何小鼠的每个组织、每个器官的密码子usage的规则，我们用数据库来深度学习每个组织它怎样去使用密码子usage，由此我们开发算法，用算法来优化报告基因。

我们发现，通过学习建立肝脏特异性、中枢神经特异性，或者肌肉特异性算法，确实比起野生型和其他商业工具，有效增加了它的表达十几倍以上，但这个并不重要。

刚才讲了CpG motif是导致先天免疫反应的主要原因之一，所以我们还要看这个算法在设计过程中有没有考虑降低CpG motif，大家可以清楚的看到，我们非常有效的降低了CpG motif，同时还达到了高水平的表达。

有了这些工作后，Gessler博士开始在小鼠里实验。我们先在幼鼠当中，这个动物一般活不过4周，我们在小鼠出生第一天注射后，一年后分析，小鼠完全和正常老鼠一模一样，从组织学、神经影像学的角度是一模一样。

我们做了神经纤维束成像，就是弥散张量成像（DTI），可以看到神经纤维束，这是Canavan病模型的，这是正常小鼠的，这是基因治疗的——一看这个图像就知道接受治疗的小鼠已经接近正常小鼠，跟患病小鼠完全不同。

我们还做了静息态功能性磁共振成像，做了19个脑区的连接性分析，对比患病、正常和接受基因治疗的小鼠，能看出有明显的改善，经过治疗的小鼠更加接近正常小鼠。

我们在想如果这么早打进去，它的稳定性怎么样。大家可以看到，无论在小鼠发育的新生、幼年、成年、壮年等任何时期开始治疗，在一年的过程中都非常稳定，这就是为什么基因治疗用于中枢神经很关键。

我们还做了神经代谢组，通过分析可以看到，对比野生型、患病和基因治疗的小鼠，治疗小鼠根据治疗年龄段的不同，显著接近于野生型。

这一张是髓鞘形成，图上显示的是髓鞘，对比第7周和第10周的结果，可以看到基因治疗小鼠在4周后完全跟野生型一模一样。大家看到NAA的降低也是同样的顺序，在2周后开始降低，4周后完全成了野生型。

这一张是单细胞RNA测序的结果，发现基因治疗后小鼠的少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞更接近野生型。

这一张是用代谢成像看NAA的分布，大家一看就知道，这个是患病小鼠，这个是对照载体治疗小鼠，这个是野生型，这个是用天门冬氨酸酰化酶治疗的小鼠，可以看到明显的改善。

于是我们和‌佛罗里达大学的Barry Byrne教授进行了合作，做了一个2岁患者的同情用药。从肝功和生长曲线，还有NAA水平都有明显的效果，神经成像的结果也有明显改善。

这个孩子是同情用药或者叫扩展使用——左边是这位病人治疗前的状态，右边是治疗15个月后。多么开心的一个小男孩，这是两年后我们见面的场景，而这是5年后他已经9岁时的场景。这个孩子如果不用基因治疗已经不行了，他眼睛过去看不见，但现在我一进去他就能看到我。

最后总结一下。Canavan病在1931年被发现，我的导师在1988年发现它的生化缺陷，我在1993年克隆这个基因发现突变，用了62年时间。然后我花了20年时间到宾大找载体，在我们这边（UMass）第一个研究生开始做概念验证，我们又花了4年的时间去优化它，最后报批FDA做扩展使用，前后总共加起来是86年的时间，四代科学家把这个药做成。

重要的是，在2017年4月25日，我们进行了第一个临床试验，效果非常好。2018年我们授权给了一家生物制药公司，他们现在治疗了大概9个病人，这是其中一个病人，家长经常与我联系跟我分享他们孩子的情况。

孩子在治疗前不能翻身不能爬，在基因治疗的10个月后有能力去玩扮演医生的游戏，而没有接受治疗的病人是不可能做到的。

在基因治疗一周年之际，她的父母在网上发了一个视频，大家可以看到，孩子说出了第一声“妈”——这对病人的母亲多么重要，然后她还可以开始推着轮椅到处跑。

这是最近的发展，她完全能数到十位数。还有这个，是她开始自己走路的场景。对我自己来说，这些录像不管看多少遍都是非常动情的时刻。

我在Canavan病这个领域，1989年开始做研究，2017年第一次在病人当中试验，到今天看到病人这个情况。我觉得，不管自己付出了多大代价，多少时间、多少白天黑夜都是值得的，因为对病人来讲，我们让他变得不一样了，这是我们作为基因治疗研究者最大的幸福，谢谢大家！