还原型谷胱甘肽（GSH，Reduced Glutathione）是细胞内最重要的抗氧化剂之一，主要以还原形式存在。GSH在细胞中起到中和自由基、保护细胞免受氧化损伤、维持细胞内氧化还原平衡等作用。同时，GSH参与多种代谢过程，如解毒反应和蛋白质的二硫键还原。GSH含量的变化可反映细胞的氧化应激状态和抗氧化能力，因此，GSH检测在生物医学、营养学和药物研发中具有重要应用。
一、GSH的生物学功能
抗氧化作用：GSH通过与自由基和过氧化物反应，将其还原，从而保护细胞免受氧化损伤。其氧化产物是氧化型谷胱甘肽（GSSG），GSH和GSSG的比值是衡量细胞氧化还原状态的重要指标。
解毒作用：GSH能够与许多内源性和外源性有毒物质结合，形成谷胱甘肽结合物，通过肝脏代谢系统排出体外。
蛋白质功能调控：GSH通过与蛋白质中的巯基（-SH）反应，维持蛋白质的结构和功能，特别是在氧化应激状态下，GSH可以保护蛋白质免受氧化。
参与酶促反应：GSH是谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽转移酶（GST）等重要抗氧化酶的辅因子，在消除过氧化氢和有害化合物中起关键作用。
二、GSH检测的原理
由于GSH在细胞中的浓度较高且极易被氧化为GSSG，因此检测GSH的准确性依赖于样品处理的快速性和特异性。常用的GSH检测方法包括以下几种：
分光光度法：基于GSH与特定试剂反应生成有色产物，测定吸光度来量化GSH的含量。
荧光法：使用荧光探针与GSH特异反应，生成具有荧光信号的产物，荧光强度与GSH浓度成正比。
酶促法：通过谷胱甘肽还原酶等酶促反应，将GSSG还原为GSH，通过间接方式测定GSH的水平。
高效液相色谱法（HPLC）：HPLC可将GSH和GSSG分离，通过紫外、荧光或电化学检测器定量检测GSH。
三、GSH检测的常用方法
DTNB法（Ellman法）：
DTNB（5,5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）是常用于检测巯基化合物的试剂。GSH中的巯基与DTNB反应生成黄色化合物，吸光度可在412 nm处测定。实验步骤：
优点：操作简单，结果稳定。缺点：DTNB对其他含巯基化合物不具特异性，可能干扰检测。
将样品与DTNB溶液混合，在室温下反应10分钟。
在412 nm波长下测定吸光度。
通过标准曲线计算GSH的浓度。
荧光探针法（OPA法）：
O-邻苯二甲醛（OPA）是一种常用于检测GSH的荧光探针。OPA与GSH反应生成强荧光产物，荧光强度可用于定量。
实验步骤：
优点：灵敏度高，适用于低浓度GSH的检测。缺点：操作需荧光仪器，特异性可能受到其他胺类化合物的干扰。
将样品与OPA溶液混合，孵育一定时间。
在特定的激发波长（如340 nm）和发射波长（如420 nm）下测定荧光强度。
通过标准曲线计算GSH的含量。
高效液相色谱法（HPLC）：
HPLC可以将GSH和GSSG分离，并通过紫外或荧光检测器定量。
实验步骤：
优点：灵敏度高，能同时分离并定量GSH和GSSG。缺点：设备昂贵，操作复杂。
样品经过预处理去除蛋白质后，进行液相色谱分离。
使用反相色谱柱和适当的流动相（如甲醇-水体系）。
使用紫外检测器（检测波长一般为210 nm）或荧光检测器定量GSH含量。
酶促法（谷胱甘肽还原酶法）：
谷胱甘肽还原酶法通过测定GSSG在谷胱甘肽还原酶催化下还原为GSH的速率间接测定GSH的含量。
实验步骤：
优点：灵敏度高，适合检测低浓度的GSH。缺点：操作复杂，要求实验条件精确控制。
在反应体系中加入GSSG和谷胱甘肽还原酶，利用NADPH作为辅酶。
通过测定NADPH的消耗量（吸光度下降）来推算GSH生成量。
在340 nm波长下测定吸光度的下降速率，计算样品中GSH的含量。
