在抗体纯化工艺过程中，抗体经捕获后需进一步去除宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、抗体聚集体、抗体片段和脱落蛋白A，以达到更高的纯度。精纯一般采用两步层析以保持足够的纯化冗余，但采用一步精纯的工艺也越来越多。

精纯常用的方法

精纯常用的方法包括阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、羟基磷灰石层析和分子筛，其中阴离子交换和疏水作用采用流穿模式，阳离子交换和羟基磷灰石采用结合-洗脱模式。各个层析步骤的主要杂质去除能力见下表。

两步精纯工艺

两步精纯工艺一般会选择一个流穿模式，一个结合-洗脱模式，而单一步骤精纯一般会选流穿模式（因为捕获步骤为结合-洗脱模式）。精纯介质通常采用高效介质（直径10~30μm)以提高分离的分辨率，同时提高抗体的回收率。但采用小粒径介质同时也限制了流速，延长了纯化时间。

离子交换是最常见的精纯步骤。经典的抗体纯化步骤采用流穿的阴离子交换和结合-洗脱的阳离子交换两步精纯。阴离子交换对宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白有很好的清除作用，而阳离子交换是去除多聚体和抗体片段的有效步骤。离子交换依靠抗体和杂质表面所带电荷差异将其分离。抗体的电荷来自多个组成部分。赖氨酸、精氨酸、组氨酸可带负电荷，天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸可带正电荷，N端的氨基可带正电荷，C端的羧基可带负电荷，糖基化上唾液酸可带负电荷。抗体上的净电荷取决于抗体的等电点和缓冲液的pH，当缓冲液pH低于等电点时，抗体带正电荷；当pH高于等电点时，抗体带负电荷。所以，通过调整缓冲液的pH，可以改变其在离子交换介质上的结合和流穿。需要指出的是，虽然一半以上氨基酸本身不带电荷，但它们会通过结构影响抗体的表面电荷，也会影响邻近酸性或碱性氨基酸的电荷。

阴离子和阳离子交换的区分在于介质上的活性基团，阴离子交换介质上的活性基团为阳性(带正电荷)，可吸附流动相中的阴性离子，阳离子交换介质上的活性基团为阴性(带负电荷)，可吸附流动相中的阳性离子。活性基团还可进一步分为强活性基团和弱活性基团区分的标准是活性基团上所带电荷是恒定的还是随pH改变的。抗体纯化使用的一般为强活性介质。

离子交换层析首先要平衡介质，在介质上加载相反电荷离子，主要是钠离子或氯离子。平衡液选择的标准是抗体（结合-洗脱模式）或杂质（流穿模式）易于取代平衡时加载的反荷离子吸附在介质上，但吸附又不能太强或不可逆，从而易于洗脱。第二步是样品的加载。样品加载时的缓冲液为低盐溶液，以促进抗体（结合-洗脱模式）或杂质（流穿模式）与反荷离子交换，在介质上的吸附。第三步是淋洗。对于流穿模式，淋洗可采用平衡液，对于结合-流穿模式，淋洗可采用平衡液或可洗脱弱结合杂质的缓冲液，提高洗脱抗体纯化。结合-洗脱模式的第三步是洗脱，洗脱依靠的是增加流动相中的盐浓度，增强反荷离子与抗体在介质上的竞争，从而洗脱介质上吸附的抗体和其他物质，洗脱下物质的顺序是从弱结合组分到强结合组分。通过优化洗脱条件，可增加抗体与杂质在洗脱峰中分离的分辨率，从而有效去除杂蛋白、聚集体、抗体片段等杂质。离子交换的最后一步是再生，利用高盐缓冲液清除结合在介质上的所有物质，并在介质上重新加载反荷离子，准备下一个循环。离子交换缓冲液中的缓冲体系应该在设定pH范围提供足够的缓冲能力，没有毒性，并且与抗体和介质没有相互作用。通常缓冲组分与介质应带相同电荷，所以不会在介质上吸附。线性洗脱可提高洗脱的分辨率，但在大规模生产中，为保证操作的稳定性，一般采取阶梯洗脱。

一步精纯工艺

越来越多的公司开始使用一步精纯来提高收率和纯化速度，降低成本，如一步精纯的弱分离阴离子交换层析（WPC）方法。弱分离阴离子交换层析操作条件介于流穿与结合-洗脱之间，采用比流穿操作更低的离子浓度，以提高流动相中的杂质与介质的结合能力，提高了本步骤的杂质去除能力。低离子浓度同时也增加了抗体在介质上的吸附，造成部分抗体吸附在介质上（大部分抗体流穿）。这部分弱吸附上抗体可以通过一个短暂的淋洗洗脱，保证抗体收率。结果显示蛋白A捕获和弱分离阴离子交换组成的两步抗体纯化工艺可满足抗体在宿主细胞蛋白、蛋白A、内毒素和宿主核酸的清除要求。聚集体的清除较为复杂一些。对于部分抗体亚型，聚集体比单体的吸附能力强，聚集体可以采取WPC方法去除，但对另外一些抗体品种，单体比聚集体与阴离子交换介质的吸附能力更强，这样品种就只能通过筛选阴离子交换介质或采用结合-洗脱阴离子交换方式去除聚集体。

膜层析技术

抗体纯化技术的另一个进展是膜层析技术的广泛应用，尤其是在阴离子膜层析方面。阴离子交换层析膜与填料层析介质使用同样的活性基团，但是膜层析具有如下几个显著优势。一是速度块，膜层析通过对流方式，使杂质能够直接接触到膜上的所有结合位点，开放式的膜孔结构利用分子扩散，可同时保证高流速和高载量。二是载量高，膜层析动态载量可高达1~10kg/L膜体积，是填料层析的10~100倍。三是体积小，缓冲液用量降低。膜层析回收率可达95%~100%，在宿主细胞蛋白去除、核酸去除及病毒去除能力方面也与填料层析类似，具备替代传统填料层析的优势。膜层析为一次性使用，在成本上比循环使用的填料高。

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