这期带大家分析一下肠道菌群测序方法，是用 16S rRNA s进行测序，我会以 4 篇文献为例子，（最后有思维导图！记得领取）

这四篇文献一区无预警，而且分析方法相近，大家完全可以参照他们的分析方法分析自己的肠道菌群数据。

第一篇文献是栀子多糖通过减轻肠道菌群失调和抑制TLR4 / NF - κ B信号通路改善胆汁淤积性肝损伤。

中科院：一区

影响因子：7.7

期刊：Int J Biol Macromol

无预警

方法：

• 采用16S r RNA测序技术对小鼠粪便样本进行肠道菌群分析。

• 液相色谱-串联质谱法( LC-MS )定量分析肝脏中胆汁酸( BA )水平

• Real-time PCR、western blotting、免疫荧光、免疫组化

• FITC -葡聚糖通透性实验

• 内毒素水平分析

结果：

• 16S rRNA

（A）使用Venn图对不同类群( Vehicle-空白、ANIT + Vehicle-模型、ANIT + GPS-400-给药)共有的操作分类单元OTUs的平均数进行可视化

（B,C）在群落相似性方面，主坐标分析( PCoA )和非度量多维尺度分析( NMDS )显示，与Vehicle组相比，ANIT干预极大地影响了整体微生物组成，口服GPS 2周导致肠道微生物谱发生了显著变化

（D，E）在门水平上，ANIT + Vehicle组的变形菌门( Proteobacteria )和疣微菌门（Verrucomicrobia）的丰度增加，拟杆菌门( Bacteroidetes )和厚壁菌门( Firmicutes )的丰度减少，而GPS给药显著逆转了这些组成变化

（F，G）在科水平上，ANIT + Vehicle组的肠杆菌科( Enterobacteriaceae )丰度增加，拟杆菌目( Bacteroidales _ S24-7 _ group )和毛螺菌科（ Lachnospiraceae ）丰度减少，GPS给药也逆转了这些组成变化

（H，I）线性判别分析( LDA )效应值( LEfSe )显示ANIT + Vehicle组中肠杆菌科、肠球菌科、肠杆菌目、变形菌门和γ -变形菌门的丰度增加。GPS预处理显著阻止了ANIT诱导的肠道菌群变化。此外，GPS给药增加了胆汁淤积小鼠中拟杆菌属( Bacteroides )、噬气菌属( Gastranaerophilales )和毛螺菌科的丰度

16S rRNA最常见的几种分析方法，很多文献里都是PCoA/NMDS +phylum/family/species/genus+LEfSe（LDA）

(本文没分析species和genus水平)

• 使用花瓣图或韦恩图来进行群落分析，为研究不同的样本(组)间有哪些物种是共有的，哪些是独有的

• 主坐标分析(Principal coordinates analysis，PCoA)便是一种最经典的非约束排序分析方法。图中每个点代表一个样本，不同颜色的点指示不同的分组。坐标轴括号中的百分比代表了对应的坐标轴所能解释的样本差异数据(距离矩阵)的比例。椭圆形虚线圈，默认为95%的置信椭圆，圆圈越近表明群落越相似，越远表明群落组成差异越大，一般与空白组相比，造模会影响了整体微生物组成。

• 非量度多维尺度分析(NMDS)与上述PCoA分析类似，也是通过对样本距离矩阵作降维分解，简化数据结构，从而在特定距离尺度下描述样本的分布特征。与PCoA分析不同，NMDS分析不依赖于特征根和特征向量的计算，而是通过对样本距离进行等级排序，使样本在低维空间中的排序尽可能符合彼此之间的相似距离的远近关系(而非确切的距离数值)。因此，NMDS分析不受样本距离的数值影响，仅考虑彼此之间的大小关系，对于结构复杂的数据，排序结果可能更稳定。分析同上。

• 在物种组成分析中，参照多篇参考文献，比如上面的D、F图展示每个样本的菌群分布，E、G图展示菌群组内均值分布

phylum是细菌的最大分类层面，主要看拟杆菌门( Bacteroidetes )和厚壁菌门( Firmicutes )变形菌门( Proteobacteria )和疣微菌门（Verrucomicrobia）的变化，拟杆菌门( Bacteroidetes )通常在模型组中减少，给药组增多；变形菌门( Proteobacteria )和疣微菌门（Verrucomicrobia）通常在模型组中减少，给药组增多，厚壁菌门( Firmicutes )不一定。在门的分析中，也经常会看 Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）的比值，F/B的比例变化可能于疾病的发展密切相关，模型组相比于空白组和给药组F/B的比例会更高。

family/species/genus看结果好不好，如果结果有正确趋势且有显著性，可以增加到文章中，如果结果不好不加也没什么大碍。本片文献看了科水平

• LEfSe（LDA）分析可以直接对所有分类水平同时进行差异分析；同时，LEfSe更强调寻找分组之间稳健的差异物种,即标志物种。

LEfSe的分析结果包括两部分，分别是显著差异物种LDA值分布柱状图，用以展示每个组内显著富集的物种(注意不显示显著下调的)及其重要性程度，纵坐标为组间具有显著差异的分类单元，横坐标则以条形图直观地展示各分类单元的LDA分析对数得分值。分类单元按照得分值大小进行排序，以此描述它们在样本分组中的特异性。长度越长表明该分类单元的差异越显著，条形图的颜色指示了该分类单元所对应的丰度最高的样本分组。

物种分类学分枝图，用以展示在各组样品中标志物种的分类学层次分布。分类学分枝图展示了样本群落中从门到属(从内圈到外圈)主要分类单元的分类等级关系。节点大小对应于该分类单元的平均相对丰度；空心节点代表组间差异不显著的分类单元，而其它颜色(如绿色和红色)的节点则表明这些分类单元体现出显著的组间差异，且在该色所代表分组样本中丰度较高。字母则标识了组间存在显著差异的分类单元的名称。

一般重点分析柱状图，物种分类学分枝图则不会在结果讨论里具体分析

属水平肠道菌群与胆汁淤积的相关性分析显示，Bacteroidales _ S24-7 _ group与血清生化指标ALT、AST、ALP、TBA、TBIL和DBIL呈负相关，而Enterobacteriaceae和Enterococcus组呈正相关

此外，进一步研究发现Bacteroidales _ S24 - 7与肝脏胆汁酸TUDCA，TCA，TCA,Gca、ca、Thdca、Lca、T - Α - MCA、T - Β - MCA、T - Ω - MCA、Α - MCA、Ω - MCA等呈负相关。相反，肠杆菌科和肠球菌属与某些肝胆汁酸呈正相关，如TUDCA、TCA、GCA、CA、THDCA、LCA、T - α - MCA、T - β - MCA和T - Ω - MCA

• GPS对胆汁淤积小鼠肠道屏障损伤的影响

（A）与Vehicle组相比，ANIT + Vehicle组胆汁淤积小鼠回肠上皮出现了异常的形态学改变，如回肠上皮失去正常的绒毛结构。然而，GPS ( 400 mg / kg )给药逆转了这些变化

（B-F）此外，ANIT + Vehicle组胆汁淤积小鼠回肠组织中紧密连接蛋白ZO - 1和occludin的蛋白水平以及ZO - 1 mRNA水平均显著低于Vehicle组。然而，GPS给药增加了这些肠道紧密连接蛋白的水平

（E）GPS治疗也降低了胆汁淤积小鼠肠组织中IL - 6蛋白表达的增加( P < 0.05 )。

（G）小鼠血液FITC -葡聚糖分析发现，ANIT + Vehicle组胆汁淤积小鼠的荧光值明显较高，而在Vehicle组中，却被GPS管理减少了

（H）此外，胆汁淤积小鼠的肝脏和血清LPS水平在ANIT + Vehicle组显著升高，并通过GPS给药显著降低

• GPS对胆汁淤积小鼠TLR4 / NF - κ B信号通路及肝脏炎症的影响

（A-E）GPS ( 400 mg / kg )给药显著降低了胆汁淤积小鼠肝脏TLR4、核NF - κ B和MyD88的表达

（F-G）此外，与Vehicle组相比，ANIT + Vehicle组肝脏中NF - κ B抑制蛋白I κ B - α的表达显著降低，而TRAF2、磷酸化NF - κ B抑制蛋白p - I κ B - α和NF - κ B蛋白激酶I κ K - α的表达显著上调。然而，GPS给药下调了TRAF2、p - I κ B - α和I κ K - α的蛋白水平，并增加了I κ B - α的蛋白水平

（H，I）与这些观察结果一致，GPS给药也减少了胆汁淤积小鼠肝组织中促炎细胞因子MCP - 1和IL - 6表达的增加

• GPS喂养小鼠的FMT对受体胆汁淤积小鼠肝脏损伤的影响

（A）FMT实验的设计如图A所示。

（B）血清生化指标分析如图B所示。与FMT _ Vehicle组相比，FMT _ Vehicle + ANIT组胆汁淤积小鼠血清生化指标显著升高。同时，从GPS喂养的供体中进行FMT后，胆汁淤积小鼠的这些指标的血清水平显著降低。

（C）此外，肝脏H & E染色显示，与FMT _ Vehicle组相比，FMT _ Vehicle + ANIT组胆汁淤积小鼠肝脏组织中出现明显的肝细胞坏死和炎性细胞浸润。来自GPS喂养的供体的FMT改善了胆汁淤积小鼠肝脏组织的肝细胞坏死和炎症浸润。

• GPS喂养小鼠的FMT对受体胆汁淤积小鼠肝脏BAs稳态紊乱的影响

（A,B）肝脏中未结合、甘氨酸结合和牛磺酸结合的BAs及其总和( BAs的SUM)在FMT _ Vehicle + ANIT组中显著高于FMT _ Vehicle组，而在FMT _ Vehicle + GPS组中显著降低。

（C）此外，与FMT _ Vehicle + ANIT组的胆汁淤积小鼠相比，FMT _ GPS + ANIT组的核受体FXR和PXR的mRNA水平也显著增加。胆汁淤积小鼠肝脏BA外排转运体，如Bsep，Mrp2，Mrp4和Osta的表达在GPS喂养的供体FMT后也显著增加。

• GPS喂养小鼠的FMT对受体胆汁淤积小鼠肠道屏障破坏和肝脏炎症的影响

与FMT _ Vehicle组相比，胆汁淤积小鼠回肠组织中ZO1的mRNA水平以及ZO - 1和occludin的蛋白水平显著降低，但在GPS喂养的供体中进行FMT后，ZO1的mRNA水平以及ZO - 1和occludin的蛋白水平显著增加。GPS喂养的供体的FMT也降低了胆汁淤积小鼠回肠组织中IL - 6蛋白的表达。

此外，FMT _ Vehicle + ANIT组胆汁淤积小鼠肝脏TRAF2、p - NF - κ B、TLR4、Myd88和核内NF - κ B水平显著升高，而GPS喂养的供者FMT降低了胆汁淤积小鼠肝脏TRAF2、p - NF - κ B、TLR4、Myd88和核内NF - κ B水平。与此相一致观察发现，胆汁淤积小鼠肝组织中TLR4和NF - κ B的mRNA水平以及IL - 6和MCP - 1等炎症因子的mRNA水平也显著增加，但仍可被GPS喂养的供体的FMT降低