凝胶渗透色谱GPC原理、样品要求、影响因素、案例分析、常见问题

简介

凝胶色谱法(GPC)是一种新型的液体色谱（又名体积排除色谱(SEC）或凝胶过滤色谱(GFC)，是用溶剂作流动相，流经多孔填料(如多孔硅胶或多孔树脂) 作为分离介质的液相色谱法，是高聚物表征的重要方法之一。通过结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪。其分离部件是一个以多孔性凝胶作为载体的色谱柱，凝胶的表面与内部含有大量彼此贯穿的大小不等的空洞。GPC可同时测定聚合物的相对分子质量及其分布，对检测相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性质有重要意义。操作简便快捷、进样量小、数据可靠且重现性好、自动化程度高等。

基本原理

凝胶渗透色谱（GPC），又称体积排除色谱或尺寸排除色谱，是一种液相色谱技术，主要用于高聚物的表征。其原理是利用高分子溶液通过填充有微孔凝胶的柱子，按照分子大小进行分离。柱子内填装的凝胶可为有机或无机材料，具有各种大小不同的孔洞和通道。

图1

在实验中，将高分子溶液加入色谱柱后，通过溶剂淋洗，使体系处于动态平衡状态。在柱内，不同大小的高分子分子会以不同程度渗透到填料的微孔中。体积大于凝胶空隙的分子会被排阻，直接流出柱子，而小分子则可以完全渗入凝胶孔隙中，后流出柱子。中等大小的分子介于两者之间。

图1 GPC的分离原理，依据尺寸大小分离，大组分最先被洗提出，直径小于孔径的组分进入凝胶孔道，依据尺寸差异，样品组分分离，随后可得出高分子尺寸大小随保留时间（或保留体积VR、淋出体积Ve）变化的曲线，即分子量分布的色谱图

重要的是，凝胶渗透色谱的固定相是多孔填料，样品与固定相之间无作用力，因此溶质分子的迁移时间不同。这种技术可用于快速、自动地测定高聚物的平均分子量及分子量分布，已成为最为重要的测定聚合物分子量与分子量分布的方法之一。

样品要求

1．样品量：可为液体、粉末、块状样品，粉末样品10mg，液体5-10ml；

2．要求在指定流动相中有较好的溶解性，送样前需要自行确认好样品在指定流动相中的溶解性，难溶样品最好自行溶好再送样, 溶解后的样品要透明均一，过滤头不堵；如果样品溶解性较差，要求提前溶解好（浓度要求在2-5mg /ml左右），或者提供合理溶解方法（如果由实验室溶解，费用问题请提前咨询）

3．样品溶好之后，有机相样品需要过0.45 μm滤膜，水相样品需要过0.22 μm滤膜，样品浓度一般控制在2-5 mg/mL；样品溶好过滤膜后，可能会损失部分样品信息，建议最好送粉末；

4．高温相要保证在该测试温度下样品不分解；并样品不能含F，含F会分解污染柱子

影响因素

色谱柱：GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心细管中加入孔径不同的微粒作为填料。每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大的凝胶的尺寸还大，这时高聚物进入不了凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，这就没有达到分离不同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞凝胶孔的可能，影响色谱柱的分离效果，降低其使用寿命。色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不同相对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子质量范围相配的色谱柱。

2.填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最基本的要求是填料不能被溶剂溶解）：交联聚苯乙烯凝胶（适用于有机溶剂，可耐高温）、交联聚乙酸乙烯酯凝胶（最高100℃，适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂）多孔硅球（适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔氧化铝（适用于水和有机溶剂)

3.溶剂的选择：能溶解多种聚合物；不能腐蚀仪器部件；与检测器相匹配。

a. 常温流动相: 水相、THF、DMF、DMSO、三氯甲烷、六氟异丙醇、a-氯奈；

b. 高温流动相：DMF（80℃），三氯苯；

c. 可以测相对分子量的流动相：水相、THF、DMF、DMSO、三氯甲烷、六氟异丙醇、a-氯奈、三氯苯

d .可以测绝对分子量的流动相：水相、THF、DMF、三氯苯

不同流动相对应的分子量范围：DMF：3000-100万；THF：500-200万；水相：300-50万；氯仿相：500-200万。分子量接近限值的，测试不太准确，低于下限会跟溶剂峰连在一起测不准。

4.激光光散射实验中必须对样品严格除尘，溶液中的灰尘会产生强烈的光散射，严重干扰聚合物溶液光散射的测量。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应进行精馏，并经过0.2μm超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.2μm的超滤膜过滤。另外，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水强力冲洗。

案例分析

凝胶色谱常用于检测高分子材料的分子量及分布，分析材料的各组分含量，不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离脂溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于小分子化合物。相对分子质量相近而化学结构不同的物质，不可能通过凝胶渗透色谱法达到完全分离纯化的目的。凝胶色谱不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量相差需在10%以上才能得到分离。

主要应用于聚合物分子量及其分布、聚合物的支化度、共聚物及共混物的组成、聚合物分级及其结构分析等。适于分析水溶液中的多肽、蛋白质、生物酶等生物分子。

图2

图3

图4

常见问题

1. 为什么样品要求在指定流动相中溶解性要好？

因为GPC（凝胶渗透色谱）本质上是一个色谱测试，是通过色谱柱分离不同分子量的成分，溶解性不好的话是需要过滤后测试的，不溶成分的分子量就无法测试，而且如果样品溶解度差的话，样品有可能会在色谱柱析出，毁坏柱子

2. 为什么测试结果跟预期分子量差别较大？

第一，gpc的测试原理是每种流动相都有对应的一种标准物质作出的标准曲线，样品测试结果要跟标曲比较，然后得出测试结果，所以大多数流动相得到的结果是样品的相对分子量，如果样品跟标准品差别太大的话，测试结果就有可能跟真实值相差较大；第二，GPC一般测试样品都是聚合物，预期分子量只是基于实验设计的一个预期值，所以有时候跟实际情况有出入也是正常的。

3. 相对分子量和绝对分子量的区别？

第一，测试原理不同：相对分子量时通过建立标准物质的标准曲线，待测样品与之相比得到分子量分布；绝对分子量是通过三联检测器，主要是激光检测器在样品颗粒表面散射角度不同通过数学模型计算分子量分布；第二，检测器不同：相对分子量主要是折光示差检测器，绝对分子量需要示差、粘度、光散射三联检测器；第三，检测分子量范围不同：相对分子量可以检测较小分子量，而一般分子量在几万以上才适合绝对分子量

GPC各个流动相之间有什么差别？

不同流动相对应分子量范围不同：DMF:3000-100万；THF：500-200万；水相300-50万；氯仿500-200万。高温相要保证在该测试温度下样品不分解，目前高温流动相是三氯苯相，是针对高温溶解后降温会析出的样品，如果溶解后降温不析出样品可测常温GPC。

4.样品基质中有大量高分子脂类， SPE小柱分离效果不佳，没有类似SPE小柱那样的凝胶色谱小柱，可以起到分离大分子物质的效果？

理论上液相接上凝胶色谱柱不接检测器可以达到净化效果，把收集到的溶液再浓缩定容即可。目前市面上有一类多功能净化住内含有多重吸附基质，可快速、选择性地吸附样品中的脂类、蛋白质、色素等杂质，且不吸附待测组分，达到快速净化的目的。

5.GPC系统如何平衡？

1)安装色谱柱之前，用两通管连接管路，用流动相替换系统后换上GPC柱子；(注意溶剂互溶情况)

2)RID平衡操作

分析开始前，用流动相冲洗检测器流路。流动相流速1ml/min，切换到RFlow，使流动相通过检测池的样品池和参比池，冲洗20min左右。然后切换RFlow 流路数次，将气泡赶出检测池。关闭RFlow，等待基线平稳。当Balance值高于50，进行Balance调整；

3)色谱柱平衡

等溶剂峰出峰后在经过约一次分析时间后基线才能走平。

6.GPC仪器对载体的要求？

1)良好的化学稳定性和热稳定性；

2)有一定的机械强度；

3)不易变形；

4)流动阻力小；

5)对试样没有吸附作用；

6)分离范围越大越好(取决于孔径分布)等；

7)载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧密，色谱柱分离效率愈高。

7.怎么选择溶剂？

测试前客户需要做溶解性试验确保样品可以完全溶解于流动相中。比如，客户需要用DMF流动相GPC测试样品分子量。取1～5mg样品和1mL DMF溶剂混合，在室温下或者50～80度下加热，如果样品可以完全溶解，则可以测试。如果无法完全溶解，则不适合测试。确保分子量在1000～60万之间，否则可能没有信号。详情可参考(GPC测试(凝胶渗透色谱)-剂拓材料检测服务

8.样本的准备？

激光光散射实验中必须对样品严格除尘。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应进行精馏，并经过0.2μm超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.2μm的超滤膜过滤。另外，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水强力冲洗。

9.为什么要用GPC方法？

相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性质有重要影响。在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们关注的热点后，经典方法却不能同时测定聚合物的相对分子质量分布。凝胶渗透色谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和有效的技术。