Nature系列重磅论文：首次全面总结细胞衰老和组织衰老的标志物
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细胞衰老影响疾病发生，涉及多标志特征如细胞周期停滞、SASP、核变化等。SenNet联盟提出识别衰老细胞的建议，挑战包括缺乏特定标记和广泛接受的衰老定义。衰老研究面临技术挑战，需多标志综合识别。
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有用
有用细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态，在人类、小鼠和其他一些物种中，衰老细胞的积累已被证明可加速多种疾病的发生。
衰老受各种内在和外在因素的影响，早在胚胎发生期间就可以观察到衰老。尽管衰老在组织修复、伤口愈合和胚胎发育过程中是一种重要的生理程序，但在其他情况下，它通常是随机应激的结果，要么是急性发生的，要么是长期积累的。例如，许多抗癌疗法对健康的非癌细胞具有诱导衰老的不良作用，从而导致局部和全身炎症。
尽管组织中驱动细胞衰老的机制尚不完全清楚，但有证据表明，衰老细胞的积累与慢性炎症有关，并导致组织功能障碍。衰老细胞随着年龄的增长而积累的原因（是产生更多的衰老细胞还是衰老细胞清除减少）目前还没有得到很好的理解。一些证据表明，免疫系统清除衰老细胞的能力随着年龄的增长而下降，这也导致它们在组织中积累。
近年来，科学家对揭示细胞衰老的生理功能和病理后果及其潜在分子机制的兴趣日益浓厚。然而，体内衰老细胞的鉴定、表征和分离面临着相当大的挑战，部分原因是技术上的复杂性，导致对哺乳动物细胞衰老的了解过于片面。这其中一个关键的挑战是缺乏细胞衰老的特定标记，因为几乎所有已经提出的标记都可能在特定背景下(例如，细胞类型，衰老类型)缺失，或者它们可以存在于非衰老细胞中。此外，缺乏被广泛接受的衰老表型定义进一步阻碍了这一领域的进展。
美国国立卫生研究院(NIH)细胞衰老网络(SenNet)联盟旨在利用最先进的单细胞技术，绘制人类和小鼠一生中多种组织中的衰老细胞图谱。SenNet的生物标志物工作组观察到，在衰老和与年龄相关的条件下，科学文献中关于各种组织中细胞衰老的反复出现的问题，即细胞状态注释过度简化的趋势，由于缺乏普遍接受的细胞衰老定义而加剧。而且，相当一部分文献严重依赖于均质组织样本的分析，大大忽视了不同细胞类型的独特属性。
2024年6月3日，来自美国国立卫生研究院SenNet联盟的多位教授在Nature Reviews Molecular Cell Biology（IF=112）杂志发表题为“SenNet recommendations for detecting senescent cells in different tissues”的文章。
在这篇专家推荐中，研究团队首先介绍细胞衰老的九大标志。随后，研究团队探讨了正常衰老和疾病过程中，14种组织中的衰老标志物，并指出目前识别组织衰老细胞的挑战。最后，研究团队提出了使用衰老标记物、人工智能和循环标记物和技术来识别和表征衰老细胞的建议。
细胞衰老的标志
衰老细胞的特征是缺乏增殖和抗凋亡途径上调。它们分泌大量趋化因子、细胞因子、生长因子和蛋白酶，称为 衰老相关分泌表型(SASP)。细胞衰老的其它特征是染色质结构的变化、代谢适应、受损大分子的积累和基因组不稳定性。值得注意的是，单个标志的存在不足以定义衰老状态，因为它们也可以在其他细胞状态中找到。因此，需要存在多个标志才能识别衰老细胞。在本节中，重点介绍了已知的九种主要衰老标志。
图1 细胞衰老的标志
1、细胞周期停滞
许多衰老细胞会积累CDK2抑制剂CDKN1A和CDK4/6抑制剂CDKN2A，导致RB家族蛋白持续低磷酸化，抑制E2F转录因子，下调增殖标志物MKI67，随后导致细胞周期停滞。这种阻滞是由多种因素造成的，包括E2F靶基因的染色质变化和核糖体生物发生缺陷。然而，目前还没有特定的标志物专门指示衰老细胞周期阻滞。例如，RB和p53的激活(在人类中由TP53编码，在小鼠中由Trp53编码)也发生在其他形式的细胞周期阻滞中，CDKN2A在某些非衰老细胞中也有表达。因此，检测与衰老相关的细胞周期阻滞需要量化多种因素和特征。
2、SASP
衰老细胞会分泌多种促炎细胞因子、趋化因子、白细胞介素（如 IL-6、IL-1α 和 IL-1β）、细胞生长调节剂、蛋白酶及其抑制剂、血管生成因子和不溶性因子，如纤连蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，以及其他炎症分子，如 GDF15、TGFβ1 和 IFNγ，统称为 SASP。SASP的组成和强度可能因衰老持续时间、衰老刺激的来源和特定细胞类型而异。单细胞 RNA 测序揭示了 SASP 因子表达的细胞间差异很大。衰老可以传递到邻近细胞，这种现象通常称为继发性衰老。已描述了两种传递机制：旁分泌衰老由 SASP 介导，而近分泌衰老涉及细胞与细胞之间的直接接触，由 NOTCH1–JAG1 信号传导介导。
3、核变化
衰老细胞的细胞核经历了具有重要功能意义的实质性变化。组蛋白的翻译后修饰和DNA甲基化变化有助于衰老过程中异染色质的全局丢失和局部异染色质的增加、LINE-1的激活和衰老相关膨胀(SADS)的出现。Lamin B1 (LMNB1)的缺失导致了Lamin相关结构域的缺失和基因表达的改变。癌基因诱导的衰老的特征是形成衰老相关的异色灶(SAHF)，这是可见的DAPI密集灶，由Lys9位点三甲基化的组蛋白H3修饰的染色质核(H3K9me3)和H3K27me3修饰的染色质壳组成。这种表型可以在细胞培养的其他形式的衰老中观察到，例如复制性衰老，尽管程度较轻。据报道，PML核小体通过调节E2F因子介导衰老。HMGB1是一种高迁移性蛋白家族的蛋白，参与染色质结构和基因表达的调控，在细胞衰老过程中从细胞核释放到细胞外环境。它在细胞外的存在对免疫细胞来说是细胞应激或损伤的信号。
4、细胞表面标志
已经研究了几种蛋白作为细胞培养和组织中使用可诱导的CDKN2A或CDKN1A表达系统(DEP1, NTAL, EBP50, STX4, VAMP3, ARMCX3, B2MG, LANCL1, PLD3和VPS26A)鉴定衰老细胞的潜在标记。此外，DPP4、TNFRSF10D(也称为CD264)、NOTCH1、NOTCH3、CD36、氧化Vimentin、ICAM1、uPAR、CD274、PDL2和MHC I类分子也被用作衰老的标记物。
5、细胞形态的变化
在细胞培养中，衰老细胞会发生明显的形态变化：它们变得扁平、增大和空泡化，并且可能显示多个或增大的细胞核。衰老细胞建立细胞质桥，使它们能够通过直接的细胞间蛋白质转移向邻近细胞发出信号。培养中的衰老细胞已被观察到显示增大的细胞核、核起泡和细胞质染色质碎片 (CCF) 的形成。CCF 是由染色质通过核膜起泡而产生的，而这种起泡是由核层完整性受损介导的，并通过 cGAS-STING 通路触发干扰素反应。
6、溶酶体含量增加
在衰老细胞中，溶酶体的数量和大小都会增加。这种增加主要包括含有不可消化的自发荧光物质的溶酶体，例如脂褐素，它是氧化蛋白质、脂质和金属的聚集体，会积聚并可通过组织化学染色苏丹黑 B 检测出来。溶酶体质量的增加与衰老相关的 β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 活性有关。
7、代谢适应
衰老细胞的特点是产生能量的氧化代谢增强，超过增殖细胞，从而维持对细胞生存至关重要的 ATP 消耗蛋白质应激途径 。线粒体功能障碍的许多驱动因素也会导致细胞衰老。这些驱动因素包括线粒体 DNA ( mtDNA ) 的耗竭和突变、电子传递链的抑制剂、HSPA9 的丢失、SIRT3 和 SIRT5 的丢失以及复合物 I 组装的中断。线粒体功能障碍相关的衰老主要是由细胞浆 NADH 的积累引起的，导致 ATP 耗竭和 AMPK激活以及细胞周期停滞。
衰老细胞的特征还在于活性氧 (ROS) 生成增加，主要由功能失调的线粒体产生。细胞内和细胞外的 ROS 均可促进衰老的诱导和稳定细胞周期停滞。衰老细胞中的部分线粒体表现出线粒体外膜通透性，mtDNA 由此释放到细胞质中，从而促进 SASP 。
8、DNA损伤
为应对 DNA 损伤，细胞会激活 DNA 损伤反应 (DDR)。DDR 通过 ATM 介导和 ATR 介导的 p53 稳定化触发细胞衰老，从而激活 CDKN1A 以停止细胞周期进程。持续的 DDR 还会触发 SASP 。DNA 损伤位点的组蛋白 H2AX（称为 γH2AX）的 Ser139 磷酸化促进了检查点因子和 DNA 修复因子的聚集，包括 TP53BP1、MDC1、NBS1 和磷酸化的 SMC1；在衰老的成纤维细胞中也可以观察到 RAD17 的磷酸化。在衰老过程中，端粒DNA损伤和磨损已被证明会导致与端粒共定位的 DDR 焦点（例如 γH2AX 和 TP53BP1）的形成，称为端粒相关焦点 (TAF )。
9、抗凋亡途径的上调
衰老细胞通常表现出参与抗凋亡途径的蛋白上调。RNAi靶向生存途径因子(ABL1、EFNB1、BCL2L1、EFNB3、SERPINB2和PI3K)，显示衰老细胞的活力比非衰老细胞更大程度地降低。
组织中的衰老标志物
在本节中，重点讨论了在正常衰老和衰老相关疾病的背景下，对小鼠和人体组织中衰老标志物的理解。该研究的重点是利用多种特征来支持细胞衰老的存在。按组织分类标记的数据库包含来自224篇同行评审论文和328种标记物的信息，涵盖了14种小鼠和人体组织，以及循环标记物。
表 1列出了数据库中记录的三种或更多种组织中的衰老标记物。总的来说，这些标记代表了9个衰老标志中的6个，其中SASP最具代表性。在SASP中，IL-6、TNF、IL-1α、IL-1β、SERPINE1(也称为PAI-1)和tgf - β1已在十多个组织中被报道。值得注意的是，CDKN2A和CDKN1A是细胞周期阻滞的主要标记物。H2AX是评估组织间DDR最常用的标记物，其次是端粒长度和TAF。SA-β-gal染色显示11个组织中溶酶体含量增加，5个组织和7个组织中分别记录了LMNB1和核HMGB1缺失所证明的核变化。抗凋亡因子BCL2在4个组织中上调。
表 1 在三种或更多组织中描述的细胞衰老标志物
除了标记优先级之外，不建议使用单个标记来确定细胞的衰老状态，因为存在充足的所谓假阳性衰老的证据(框1)。因此，专家建议是要求在同一细胞中存在多个衰老标志，如框2所述。随后，进一步讨论了衰老和疾病中每个组织中存在的衰老标志物的主要发现。
框1 在体内组织中识别和表征衰老细胞的关键挑战
框2 关于使用衰老标志物的建议
1、心血管系统
多项研究表明，在衰老和心血管疾病背景下，各种心血管细胞谱系(如心肌细胞、心脏间充质基质细胞、心脏成纤维细胞和心脏祖细胞)中都存在衰老相关标记物的积累。
在正常衰老过程中，小鼠心肌细胞积累了以下衰老相关标志物:TAF、周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKN1a、CDKN2B(也称为p15INK4b)和CDKN2a)、SA-β-gal活性、SADS和促纤维化SASP。在小鼠中，衰老的心脏间充质间质细胞鉴定为PTPRC-PECAM1-ATXN1+PDGFRA+(也称为CD45-CD31-SCA1+ PDGFRA+)的克隆生成和增殖能力下降，这与Cdkn1a, Cdkn2b和Cdkn2a和SASP因子的mRNA表达增加有关。在人类中，定义为KIT+PECAM1-PTPRC-(也称为c-kit+CD31-CD45-)的心脏祖细胞显示CDKN2A水平增加，SA-β-gal活性增加，γH2AX灶减少。血管衰老的特征是动脉增厚、僵硬和内皮功能障碍。多种衰老相关标志物，包括细胞周期抑制剂(Cdkn2a、Cdkn1a和Trp53)、DNA损伤灶和SASP因子，在衰老小鼠的主动脉中上调。内皮细胞和血管平滑肌细胞是主动脉的主要细胞类型，在小鼠衰老过程中表现出衰老相关的标志物。
小鼠心肌梗死与衰老相关标志物(如CDKN2A和CDKN1A)、SA-β-gal活性、TAF表达增加以及小鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞中SASP成分表达增加有关。在人类和小鼠模型中，衰老相关标志物也被发现存在于血管疾病，如动脉粥样硬化、腹主动脉瘤和胸主动脉瘤。在小鼠动脉粥样硬化模型(Ldlr -/-)中，晚期动脉粥样硬化病变表现为SA-β-gal表达和Cdkn2a和典型SASP成分上调。此外，在人类中，从动脉粥样硬化斑块中分离的血管平滑肌细胞也表达衰老相关标志物，包括CDKN1A、CDKN2A和SA-β-gal活性。衰老相关的标志物，包括CDKN1A、p53、端粒相关的总γ - h2ax和γ - h2ax (TAF)以及SASP因子，也在胸主动脉瘤和腹主动脉瘤的人和小鼠模型中被观察到。
2、免疫系统
免疫衰老导致机体对感染性疾病的易感性增加，对疫苗的反应性降低。这种表型可能涉及免疫细胞衰老，特别是在T细胞中。研究表明，免疫细胞，包括单核细胞和组织内巨噬细胞，是SASP因子如IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF和HMGB1的主要产生细胞。由于SASP的特征与免疫细胞的特征重叠，因此必须确定能够区分活化的常驻免疫细胞和真正的衰老细胞的标记物。这一未满足的需求仍然是该领域的一个重大空白，对免疫系统衰老的研究提出了挑战。
组织驻留免疫细胞，如巨噬细胞、2型先天淋巴样细胞、自然杀伤细胞、B细胞和效应记忆T细胞依靠增殖来维持自身功能。这些细胞亚群中的每一个都表现出与年龄相关的功能障碍，并产生与SASP因子重叠的促炎细胞因子，从而为年龄和衰老对免疫细胞的影响提供了证据。最近对老年人血小板的研究发现，SELP (CD62P)、CD40LG和CD63水平升高，表明存在与年龄相关的血小板活化增加。具有高SA-β-gal活性的CD8A+ T细胞亚群(也表现出端粒功能障碍介导和Cdkn2a介导的衰老特征)和CD8A+效应记忆T细胞显示由p38 MAPK调节的SASP。
使用大量外周单核血细胞的转录和翻译测量已经鉴定出各种细胞周期调节因子，包括CDKN2A、p53、CDKN1A、CDKN1B和p38 MAPK，其中一些标记物的变化与衰老和/或各种慢性疾病有关。从老年小鼠和缺乏ERCC1(一种关键的DNA修复蛋白)的小鼠血液中分离的CD3+ T细胞表现出多种衰老标志物水平升高，包括Ccl2、Tnf、Il1b、Inhba、Spp1、Cdkn2a和Cdkn1a。相比之下，疫苗激活的小鼠CD8A+ T细胞转移到新小鼠后，在原小鼠的寿命之外仍能保持功能和增殖能力，这表明衰老的决定因素不随T细胞转移，而可能来自新宿主。同样值得注意的是，由于表达CDKN2A的外周单核血细胞似乎不能在低温保存中存活，因此定量PCR (qPCR)测定外周T细胞中CDKN2A mRNA水平的方法主要使用从新鲜血液中分离的CD3+细胞来确保衰老亚群的特征。最近，有报道称循环衰老的髓样细胞会驱动神经变性和脑炎症。
3、骨髓
骨髓具有动态的组织微环境，依赖于间充质干细胞、造血干细胞和其他细胞的增殖和分化。骨髓血管细胞、间充质细胞和小梁细胞群之间的生理平衡支持适当的造血干细胞生态位，这是产生不同血细胞谱系所必需的。研究已经确定癌基因诱导、辐射诱导和衰老诱导会使骨髓衰老细胞积累。这些细胞存在于不同的组织室中，与正常细胞相比，它们的功能受损，从而导致免疫系统衰退、骨质疏松和癌症等疾病。
在小鼠急性髓性白血病模型中，骨髓细胞qPCR显示衰老标志物Cdkn2a、Cdkn1a和SASP因子上调，Lmnb1下调。在辐照诱导的衰老模型中，SA-β-gal活性阳性的细胞比例，以及标记Cdkn2a、Cdkn1a和几种SASP因子的比例都显著上调。与小鼠类似，在老年人的骨髓样本中也发现了骨髓衰老的标记。通过qPCR分析，含骨和骨髓组织的针活检显示CDKN2A和CDKN1A水平升高，SASP随着年龄的增长而增加。单细胞转录组学显示CDKN1A、TGFB1和SASP因子也随年龄显著增加。
4、中枢神经系统
人类和小鼠的有丝分裂后细胞和中枢神经系统的祖细胞类型，包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞谱系细胞和内皮细胞，在衰老和疾病的背景下表现出衰老相关的细胞周期调节因子(CDKN2A、TP53和CDKN1A)和SASP因子(CCL2、IL1A、IL1B、IL6、MMP1、MMP3、SERPINE1、SPP1和TNF)的组合过表达。SA-β-gal活性水平升高、凋亡(Bcl2)和DNA损伤(γ - h2ax和磷酸化p38 MAPK)调控因子的表达以及LMNB1的下调是年龄相关或神经退行性相关的神经元和胶质细胞的额外特征。衰老细胞的药理学和药理学清除小鼠模型已被用于验证这些标记和相应的衰老或病变表型的调节。重要的是，衰老小鼠和人类大脑中衰老的复杂异质性保证了细胞类型特异性和区域特异性的表征。
大脑衰老的衰老谱也发现于受神经退行性病变影响的组织，如阿尔茨海默病和帕金森病。阿尔茨海默病个体大脑的单核测序显示，兴奋性神经元中的衰老标记与Tau病理一致，CDKN2D通过计算被确定为阿尔茨海默病的显著衰老标记。阿尔茨海默病组织中内皮细胞和小胶质细胞中的SERPINE1、CDKN2A、CDKN2D、CDKN1A、IL-1β、IL-6和CXCL8水平也高于对照脑组织。
与健康人的大脑相比，帕金森病患者的黑质中SATB1(一种CDKN1A抑制因子)水平降低，CDKN2A、MMP3、IL-6、IL-1α和CXCL8水平升高，表明衰老负担增加。最后，小鼠氧化应激(包括辐射)、代谢和炎症应激(包括肥胖和酒精中毒)模型概括了小鼠大脑中年龄相关和疾病相关衰老的特征，其特征是CDKN2A、CDKN2D、CDKN1A、p53、IL-1α、IL-1β、IL-6和SA-β-gal表达增多。
5、脂肪组织
脂肪组织中衰老细胞的积累与衰老和年龄相关疾病的组织功能障碍有关。人和小鼠脂肪组织中的衰老细胞的特征是CDKN2A和CDKN1A的表达，SA-β-gal活性升高，DNA损伤(γ - h2ax)和细胞增殖阻滞(MKI67)，以及SASP因子的表达，包括IL-6、CXCL8(也称为IL-8)、IL-1β、TNF、CCL2、SERPINE1、MMP3和MMP12。
来自老年供体(人和小鼠)的脂肪组织来源的间充质干细胞表现出衰老特性和受损的再生潜力。一项单细胞转录组学研究发现，老年小鼠脂肪组织来源的间充质干细胞中存在Cdkn1高衰老样细胞群，并伴有Il6、Il15、Vegfa、Cxcl2、Ccl2和Cxcl1的上调。值得注意的是，在自然衰老和肥胖中，Cdkn1高表达细胞的积累比Cdkn2高表达细胞的积累更多，这表明脂肪组织中衰老细胞群的异质性和复杂性。
成熟的人类脂肪细胞在肥胖和高胰岛素血症刺激下经历衰老，表现出过早衰老的转录组和分泌特征，包括CDKN2A、CDKN1A和CCND1基因表达上调，HMGB1和HMGB2基因表达下调。此外，SASP蛋白CXCL8、SERPINE1、CXCL2和MMP14的分泌增加。随着衰老和肥胖，来自衰老细胞的SASP因子上调脂肪免疫细胞中的CD38，从而降低NAD+水平，从而导致代谢功能障碍增加和整体健康水平下降。肥胖时，TNSF8+PDCD1+CD44+CD4+ T细胞在脂肪组织中积累，呈现衰老特征，SPP1、CDKN2A、CDKN1A表达增加，SATB1、DUSP10、EEF1A表达减少。
此外，在衰老等条件下，脂肪组织中某些标志物的表达与衰老呈正相关，包括IFI27、INHBA、BDNF、NRIP1和CCAR2。相比之下，KL、SIRT1、SREBF1、GDF15、MDM2、RRAD和GBP1等标记物被报道为脂肪组织细胞衰老的负调控因子。
6、肾脏
在健康衰老和肾病期间，在几种人类和小鼠肾细胞类型中观察到衰老。小鼠肾小球内皮细胞和近端小管上皮细胞(TECs)随着年龄的增长而衰老，SA-β-gal染色和Cdkn2a表达增加。衰老的肾小球内皮细胞过表达CDKN1A、TP53BP1、γ -h2ax以及SERPINE1。Serpine1过表达导致足细胞脱离和凋亡，导致肾小球硬化。老年小鼠肾脏衰老足细胞过表达衰老标志物和SASP因子，包括Irf5、Cebpb、Jdp2、Ccl2、Ccl3、Ccl5、Ccl8、Mmp12、Mmp13和Gsk3b。Il1b、Il6和Mmp13在老年小鼠肾脏中也上调。在急性肾损伤、糖尿病肾病、肾小球肾病、慢性肾病和慢性缺血性肾损伤的小鼠模型中也观察到衰老细胞。不同肾脏疾病动物模型均表现出SA-β-gal活性升高，Cdkn2a、Cdkn1a、Trp53和SASP成分(包括SERPINE1、IL-1β、IL-6、TNF和MMP13)过表达。SERPINE1在糖尿病早期肾损伤中驱动肾小球硬化。
大多数人类肾脏肾病与细胞加速衰老有关，CDKN2A在tec中过度表达最多，此外，核CDKN2A水平在肾小球疾病患者的肾小球和间质细胞中升高，在糖尿病肾病患者的小管和足细胞中升高。值得注意的是，最近的一项研究表明，由于血管和溶血损伤或其他原因，铁的积累会促进肾脏和其他器官的纤维化和衰老。衰老细胞也持续积累铁，即使细胞外铁水平在损伤后恢复正常。
7、肝
细胞衰老与年龄依赖性肝功能障碍和各种慢性肝病(如纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病和慢性肝炎)的发展有广泛的关系。多种肝细胞类型，包括肝细胞、肝星状细胞、内皮细胞、库普弗细胞和胆管细胞，在衰老和与年龄相关的疾病中表现出与衰老相关的标记。
对衰老小鼠肝细胞的研究表明，存在衰老相关标志物，如SA-β-gal、TAF54、核肥大、SADS、LINE-1和SASP因子表达。尽管对人类肝细胞衰老的了解比小鼠少，但在人类肝硬化中已经发现了衰老相关的标志物，如SA-β-gal。此外，CDKN1A、CDKN2A的表达和TAF的存在已在非酒精性脂肪性肝病中被发现，TAF也已在酒精性肝病患者的肝脏中被报道。
小鼠肝星状细胞在肝损伤模型中也显示出衰老相关的标志物，如SA-β-gal活性和Cdkn1a、Cdkn2a和SASP成分的表达。原发性胆汁性肝硬化是一种以慢性进行性胆汁淤积和肝功能衰竭为特征的自身免疫性疾病，在胆管细胞中发现了衰老相关标志物。
8、肺
CDKN2A是与肺衰老相关的主要标志物。已经开发了各种小鼠模型来研究Cdkn2a驱动的肺细胞衰老对外部压力的反应。此外，CDKN1A、p53和γ- h2ax在小鼠和人的肺部也随着衰老而上调。此外，研究显示SERPINE1通过激活纤维化肺病中的p53-CDKN1A-RB1通路诱导小鼠肺泡2型(ATII)细胞衰老。TGFβ1介导肺细胞衰老，TGFβ1-IL11-MEK-ERK信号传导介导小鼠衰老相关的肺纤维化。细胞外HSP90AA1激活TGFβ1信号，促进Trp53和Cdkn1a表达，诱导小鼠和人肺成纤维细胞衰老。在损伤性衰老小鼠模型中，SASP因子包括细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-10、TNF、TNFRSF1B和TNFSF12)、趋化因子(CXCL2和CXCL12)和蛋白酶(MMP8和MMP12)显著上调。
衰老细胞的积累也与肺的结构变化有关，通常被称为“老年性肺气肿”。最近的研究表明，老年哮喘患者气道平滑肌细胞中Trp53和Cdkn1a的表达增加。
越来越多的证据表明，肺气肿疾病肺II型上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞衰老增加。研究表明，细胞周期阻滞标志物(CDK1A和p53)、SASP因子(CXCL5、CXCL8和VEGFA)、SA-β-gal活性和γ - h2ax的增加与慢性阻塞性肺疾病的细胞衰老增加有关。在慢性阻塞性肺疾病小鼠模型中，Cdkn2a介导的衰老也被证明可以调节香烟烟雾介导的衰老反应。同样，衰老的肺成纤维细胞在纤维化肺病的发病机制中起着关键作用。血浆中GDF15、IL-6、CRP和TNFRSF1B的上调与肺间质性异常发生的易感性有关。在特发性肺纤维化中，衰老成纤维细胞的另一个标志是抗凋亡BCL2家族蛋白(如BCL2L2、BCL2和BCL2L1)的表达增强，以及促凋亡蛋白BAK1和BAX1的水平降低。相比之下，最近的研究提供了铁在小鼠和人类衰老纤维化组织中积累的证据，从而强调了细胞代谢在衰老中的作用。铁螯合疗法是否能逆转衰老、纤维化或阻塞性肺病还有待观察。
9、胰腺
据报道，人尸体胰岛中SA-β-gal+细胞比例存在年龄依赖性增加现象。Ⅱ型糖尿病在所有年龄段中显著增加了这一比例，并伴有更高强度的DNA损伤标记TP53BP1。高脂饮食和胰岛素受体拮抗剂S961诱导的胰岛素抵抗小鼠模型显示SA-β-gal活性升高，Cdkn1a、Cdkn2a和SASP因子Il1a、Il6、Tnf、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cxcl1和Cxcl10的表达升高。通过对衰老(SA-β-gal+)和非衰老(SA-β-gal -)小鼠和人胰岛细胞的蛋白质组学分析，证实了SASP蛋白因子的分泌，并在β-细胞中描述了一种独特的SASP。在Ⅰ型糖尿病(NOD)小鼠模型中，观察到几种衰老标志物如Cdkn1a、Cdkn2a、H2ax、Il6、Mmp2、Serpine1、Il6和Igfbp3的表达。其中一些因素也在Ⅰ型糖尿病供体的胰岛中被发现。此外，性别偏倚的胰岛β细胞功能障碍可由一种继发于MAFA S64F变异的年轻人的成熟型糖尿病引起，其中转录因子MAFA中的单个氨基酸替换导致男性糖尿病和衰老细胞的积累。这些细胞的特征是表达Cdkn1a、Ankrd1、Bcl2a1d、Ccl11、Cd68、Cxcl12和Icam1, SA-β-gal活性，Lmnb1表达降低，γ-h2ax185表达升高。
在NOD小鼠的α-细胞中也发现了衰老的标记，如Cdkn1a、Cdkn2a和核Hmgb1的丢失，尽管其速率低于相同小鼠的β-细胞。然而，另一项研究没有在NOD小鼠的α-细胞或Ⅰ型糖尿病供体的胰腺中发现任何衰老标志物。在胰腺的成年细胞系中，腺泡细胞表现出最高的可塑性，允许它们在被称为腺泡到导管化生的过程中经历去分化或转分化到表达导管标记的胚胎祖表型。在腺泡向导管化生过程中，去分化的腺泡细胞进入衰老状态，其特征是细胞周期阻滞，p53、CDKN1A、CDKN2A和SA-β-gal活性的诱导。在慢性胰腺炎患者中也发现了同样的情况。
在一项对140名无胰腺疾病个体的死后胰腺的研究中，114人(81%)表现出导管病变，如粘膜细胞增生，通常与KRAS激活突变相关;导管病变在40岁以后呈增加趋势。这些KRAS突变也在胰腺导管腺癌的早期阶段被发现，在衰老标志物如p53、CDKN2A和SMAD4196出现之前。然而，由于这是一项横断面研究，这种关系只是隐含的，需要进行纵向研究来证实这些事件的时间性。
在一项涉及158例导管内乳头状粘液瘤和10例正常对照的研究中，在正常对照中既没有观察到SA-β-gal活性，也没有观察到SAHF形成。然而，在肿瘤组织中，特别是在低级别发育不良的情况下，检测到四种衰老标志物(CDKN2A, CDKN2B, SA-β-gal活性和CBX5-γ) 。有趣的是，这些标记物在向导管内乳头状黏液瘤的转变过程中丰度下降。这些发现表明衰老是在早期肿瘤阶段诱导的，可能在防止恶性肿瘤的进展中起作用。
10、骨骼
在老年小鼠中，利用磁激活细胞分选和qPCR技术在成骨细胞祖细胞、成骨细胞和骨细胞中发现了衰老标记。成骨细胞祖细胞和成骨细胞除少量SASP因子增加外，Cdkn2a显著增加。除了Cdkn2a、Cdkn1a和Trp53以及大量SASP转录增加外，骨细胞的SADS也随着年龄的增长而增加。
最近的一项研究使用CyTOF的大量细胞术分析了年轻和老年小鼠骨骼中的蛋白质水平。骨微环境中的衰老细胞主要由CD24+骨系细胞和晚期成骨细胞/骨细胞组成，定义为CDKN2A+ Ki67-BCL2 +和CDKN1A+ Ki67-BCL2 +，其他衰老标志物、SASP因子和DNA损伤标志物显著增加。尽管在小鼠中，消除表达Cdkn2a的破骨细胞祖细胞并不能减轻与年龄相关的骨质流失，但破骨细胞是否也会经历衰老尚不清楚。
在人体骨骼活检中，与年轻女性相比，老年女性(平均年龄78岁)CDKN2A、CDKN1A和衰老相关趋化因子(例如，CCL2、CCL3、CCL8和CSF1)的mRNA表达上调。在青春期后期，间充质干细胞/祖细胞经历正常的程序性衰老，这表明巢蛋白表达的丧失。
小鼠骨折后，来自骨折愈伤组织的细胞表现出Cdkn1a mRNA表达的初始增加，随后Cdkn2a表达增加，并伴随着由大量白细胞介素、NF-κ b下游因子和tgf - β1表达组成的SASP表达。局灶性放射治疗引起的疾病状态也会诱导骨骼衰老，其特征与骨折相似，是Cdkn1a的早期表达和Cdkn2a的晚期表达。靶向表达Cdkn1a而非Cdkn2a的衰老细胞可以减轻局灶性放疗诱导的骨质丢失，这表明衰老细胞亚型之间存在功能异质性。
Ⅱ型糖尿病也与骨骼细胞衰老有关。在Ⅱ型糖尿病小鼠模型(高脂肪饮食加链脲佐菌素)中，骨细胞富集的样本显示Cdkn2a和Cdkn1a的表达增加，以及主要与NF-κB信号传导和基质金属蛋白酶相关的SASP标记物。在衰老和上述疾病状态下，也可以通过SA-β-gal活性的组织学染色、SADS和TAF观察到骨骼细胞衰老，通常在骨嵌入骨细胞中。
11、皮肤
皮肤衰老受到暴露于环境因素(如紫外线辐射)的影响，这使得建立可靠的衰老标记具有挑战性。皮肤衰老是通过表皮和真皮层中SA-β-gal、α-聚焦酶、CDKN2A、CDKN1A和脂褐素的表达来鉴定的。这种表达模式与较低的MKI67表达相关，仅与端粒长度减少轻微相关。增强衰老的染色质畸变是皮肤衰老的共同特征，其特征是TP53BP1和pml的核灶阳性。在晒过的皮肤中，黑素细胞的衰老率最高，这可以通过CDKN2A的表达和TAF数量的增加以及核HMGB1的丢失来确定。
尽管具有很高的可变性(例如，体内固有衰老的人成纤维细胞的SASP包括27种不同的蛋白)，但GDF15、TNF、SPP1、TNFRSF1A、FAS、CCL3、IL-15和激活素A表达与年龄相关的疾病结局之间存在关联。在体外培养的成纤维细胞、角化细胞和黑色素细胞中，经典的SASP通常包括IL-6、IL-1α、IL-1β、MMP1、MMP3、MMP9和TNF，而在衰老皮肤的真皮成纤维细胞中，SASP中发现了高水平的趋化素。
12、乳腺
TNFRSF11A在衰老过程中表达增加，通过Cdkn2a导致DNA损伤和衰老。衰老标志物在老年小鼠乳腺和培养的原代人乳腺上皮细胞中均有发现。Cdkn2a在老龄小鼠(25-32月龄)乳腺基质细胞中的表达上调约20倍。免疫染色显示，随着年龄的增长，表达SASP因子COX2的导管频率增加。炎症的其他特征，如巨噬细胞冠状结构和Cxcl1、Cxcl2、Cxcl16、Csf1、Csf3、Ccl5和Il6，在老年小鼠的乳腺中也升高。
13、卵巢
大多数关于卵巢衰老的研究都是在动物模型上进行的。卵巢比人体其他器官衰老得更早，因为女性的生殖功能在35岁左右开始下降，并在绝经时完全停止。这一衰老过程的特点是配子数量和质量的减少，导致生殖衰老。此外，卵巢表现出年龄依赖性炎症和纤维化。然而，这些是否与衰老有关还没有最终确定。
在高龄生殖小鼠卵巢中，被归类为衰老的细胞的特征是Cdkn2a、Cdkn1a、 Serpine1和Hmgb1的表达增加。此外，这些细胞表现出溶酶体含量的增加，这可以通过脂褐素聚集体(称为“聚集体”)的积累和基质室中SA-β-gal染色来证明。SASP因子如Ccl8、CCL5和促炎相关基因Crlf1 的分泌也随着年龄的增长而增加。
除了生理衰老外，遗传毒性药物也会加速生殖衰老，如化疗药物顺铂和阿霉素，会导致SA-β-gal、CDKN2A表达增加。此外，它们引发了SASP的成分，如IL-6、Ccl2 和Tgfb1 分泌增加。在卵巢加速衰老的遗传小鼠模型中，Cdkn2a、Cdkn1a、Il1a和Il1b水平升高。此外，在卵巢功能不全小鼠模型中，观察到卵巢中SAHF的形成，表现为H3K9me3和CBX5染色升高，HMGA1和HMGA2蛋白表达升高。
绝经后卵巢的单细胞表达和染色质可及性分析显示，SASP相关基因在基质细胞(SERPINE1、TIMP1、TIMP2、IGFBP2、IGFBP3和IGFBP4)、内皮细胞(IGFBP7)和血管周围内皮细胞(CDKN1A)中表达。此外，一些CCL和CXCL基因在绝经后人类卵巢的免疫细胞中表达，可能逆转衰老的一些有害影响。
14、胎盘
发育性衰老是一种程序性的短暂细胞衰老，在哺乳动物胚胎发育中起着至关重要的作用，不仅发生在胚胎中，也发生在胎盘中。细胞滋养细胞分化为大型间充质外滋养细胞和多核连续合胞滋养细胞表现出衰老的几个特征，包括复制潜能的丧失，细胞周期抑制剂(特别是CDKN1A、CDKN1C、p53和MAPK14)的表达增加，SA-β-gal活性和脂质色素的表达增加，SAHF形成，AF和SASP因子如IL-6、IL-1β、MMP9、HMGB1、GDF15和tnf介导免疫监视和组织重构。此外，胞外滋养层细胞表现出细胞核增大，合胞滋养层细胞表现出衰老和老化的特征，如合胞结增加、纤维蛋白沉积和细胞骨架重组。此外，合胞滋养层细胞的线粒体发生形态和功能变化，其特征是体积减小和ATP产生减少，从而导致ROS产生增加，以适应胎盘中氧张力的变化。
胎盘也可能在不良妊娠结局中加速或过早衰老，如先兆子痫和胎儿生长受限。与正常胎儿胎盘相比，限制性胎儿胎盘的端粒更短，CDKN2A和CDKN1A蛋白以及EEF1A1 RNA的表达水平更高。
15、结肠
关于结肠衰老的信息有限，研究团队没有将该组织纳入数据库。据报道，匀浆组织中衰老小鼠结肠中几种衰老标记物增加。衰老相关的组织微环境促进人类结肠上皮细胞和人类衍生的结肠类器官中结肠癌的形成。
结论和展望
总的来说，根据已发表的人类和小鼠研究资料，研究团队概述了目前各种组织特异性衰老标志物，指出了对这些标记理解中的差距。为了弥补这些差距，建议采用包括几种衰老标志的多种标记方法并开发新的衰老特征框架，从而实现对组织内衰老细胞的准确识别。
经过验证的衰老生物标志物的开发代表了在理解发育阶段、衰老和各种疾病的细胞衰老方面取得的重要进展。这些生物标志物不仅有助于识别衰老细胞内潜在的治疗靶点，还有助于监测衰老细胞的清除。尽管某些标志物可能与成熟的衰老相关特征(如SASP、DNA损伤和炎症)有相似之处，但它们的全面分类仍在进行中。
衰老标记与炎症或纤维化相关的条件或实验模型重叠，这是一个重大的研究挑战。这种重叠使因果关系的建立变得复杂，因为这些标记的存在可能意味着同时发生的各种生物过程。SenNet 旨在精确定位新的特定衰老标志物，使科学家能够将它们与衰老过程中可能发生的其他类型的细胞变化区分开来。
此外，正在开发创新的机器学习和人工智能技术，以根据形态差异区分衰老细胞和非衰老细胞。再加上转基因模式生物和先进成像平台的使用，在不久的将来，人类对细胞衰老的理解会有很大的提升。
尽管对现有文献进行了全面的搜索，但该专家推荐仍有局限性。具体地说，本文集中讨论了衰老标志物在个体组织中用于衰老细胞的鉴定，建议读者阅读更多的综述文章，包括细胞衰老、转移性癌症和内分泌疾病之间的联系，以及抗衰老药物的研究现状。
参考文献：
https://www.nature.com/articles/s41580-024-00738-8
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