文章介绍

2024年3月7日，苏州大学第一附属医院心脏大血管外科科研团队在Cell Proliferation（IF=8.5）杂志发表了题为“Generation of human vascularized and chambered cardiac organoids for cardiac disease modelling and drug evaluation”的研究论文。

本研究利用人类血管化和心腔化的心脏类器官模型，为心脏疾病建模和药物评估提供了新的研究工具。通过这种先进的器官模型，可以更好地模拟人类心脏发育和心血管疾病，有助于深入了解疾病机制、进行药物筛选和评估药物毒性。

#1

摘要

Abstract

人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的心脏器官组织（CO）在模拟人类心脏发育和心血管疾病（全球死亡的主要原因）方面显示出巨大的潜力。然而，一些局限性，如可重复性低、血管化有限和心腔形成困难等仍有待克服。研究人员结合 hiPSC 衍生血管球和 hiPSC 直接分化心肌细胞的方法，建立了一种稳健生成 CO 的新方法，并研究了人类 CO 在心脏损伤建模和药物评估中的潜在应用。研究人员构建的人CO显示出血管化和腔室样结构，因此被命名为血管心脏类器官（vcCO）。这些vcCO的自发跳动率约为90%。单细胞转录组学发现，vcCO中共有六种细胞类型，包括心肌细胞、心脏前体细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。研究人员成功地在vcCO上重现了体内心脏损伤和纤维化的过程，并证明FDA批准的药物卡托普利能显著减轻心脏损伤引起的纤维化和功能障碍。此外，人vcCO对阿霉素表现出明显的药物毒性反应，且呈剂量依赖性。研究的数据表明，vcCO有望成为了解心血管疾病病理生理机制、制定干预策略和筛选药物的有用模型。

#2

研究思路

Methods

研究团队设计了一个三步法来改善人类心脏类器官的血管化和心腔化特性，提高了器官模型的可重复性。

首先，诱导人类诱导多能干细胞（hiPSC）聚集逐渐向中胚层分化，并形成血管细胞以形成血管球体；

其次，用纯化的心肌细胞包裹每个血管球体以形成新的球体；

最后，诱导中央血管细胞在心肌细胞包裹下对VEGF梯度的反应进行外移，并使外周心肌血管化。

这一方法使得在hiPSC-CM包裹后的2天内就能获得跳动的心脏类器官，跳动通常在5天后稳定，对应于hiPSC分化启动后的15天。通过明场图像观察到明显的形态学变化，如球体大小逐渐增加。

#3

主要结果

Results

从 hiPSC 生成腔体和血管化的 vcCO

研究人员采用了一个三步方法，包括诱导hiPSC聚集体向中胚层和血管细胞命运分化形成血管球体，将血管球体包裹在纯化的hiPSC-CM周围，并诱导中心血管细胞的外移，以在VEGF梯度的作用下使外周心肌血管化。生成的vcCO表现出中央腔室和血管化，具有较高比例的跳动CO和类似腔室结构。共聚焦成像显示了被心肌细胞和内皮细胞包围的腔室。vcCO在培养基中保持自发跳动至少8周。

为了更好地观察类器官的3D结构，研究人员利用免疫荧光标记结合组织透明化及3D成像技术在光板显微镜下进行全景扫描。可以明显看到，第10天的血管球已出现明显的血管网络生成，而第25天的vcCO中血管网络明显有序，且由内向外蔓延（图 1）。上述结果说明通过该方案生成的 hiPSC 衍生心脏类器官具有中央腔室和血管化的特征。

图1 使用来自人类诱导性多能干细胞 (hiPSC) 的内皮细胞生成和表征心脏血管类器官 (vcCO)。 (A) 生成具有血管系统的腔内心脏类器官的 3D 培养方法示意图。 (B) 类器官形成过程中不同阶段的 hiPSC 衍生球体的代表性明场和核染色图像。比例尺表示 100 μm。 (C) 不同阶段球体的直径。 (D) 第 15 天显示自发跳动的 vcCO 比例 ( n  = 5)。 (E) 有腔的 vcCO 比例 ( n  = 5)。 (F) 在指定天数（D10、D15 和 D25）对血管球（VS）和心脏类器官的内皮细胞（PECAM1，红色）、心肌细胞（α-辅肌动蛋白，绿色）和细胞核（Hoechst 33342，蓝色）进行整体染色。比例尺表示 50 μm。（G）使用光板显微镜对整个 VS（D10）和 vcCO（D25）进行 3D 重建。（G）中突出显示的不同组件在所有图像中都以颜色编码（PECAM1，红色；cTnT，白色；Hoechst 33342，蓝色），比例尺表示 100 μm。（H，I）在 D25（n  = 5）时对 vcCO 中心脏（TNNT2、MYH7、MYH6）和内皮（PECAM1、CHD5、CD34）特异性标志物的 mRNA 水平进行实时 PCR 分析。

通过单细胞转录组学分析vcCO的细胞组成

通过对人类心脏类器官（vcCO）进行单细胞转录组学分析，研究人员揭示了其复杂的细胞组成。在第25天的scRNA-seq分析中，数据被自动聚类为15组，进一步识别出六种主要的细胞类型，包括心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、心脏前体细胞、神经细胞和间叶细胞（图 2）。其中，心肌细胞是最主要的细胞类型，占据所有活细胞的显著比例（约71.76%）。流式细胞术分析进一步确认了心肌细胞的高比例，并揭示了内皮细胞和成纤维细胞的相对比例。热图分析显示了心肌细胞和内皮细胞在基因表达上的特异性，如心肌细胞中的TNNT2、MYH7和ACTN2，以及内皮细胞中的CDH5和PECAM1。基因本体（GO）分析揭示了这些细胞类型在功能上的不同富集，如心肌细胞的肌节组织和肌肉收缩功能，以及内皮细胞的血管生成功能。与人类胎儿和成人心脏的数据比较显示，vcCO的心肌细胞状态更接近成人心脏。这些发现确认了vcCO的多细胞类型组成，并强调了心肌细胞在其中的核心地位。

图 2 具有多种心脏特异性细胞谱系的人类心脏血管束 (vcCO) 的单细胞 RNA-Seq 分析。 (A) 基于转录组相似性的聚类的 t 分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 可视化，揭示了 vcCO 中的 15 个细胞簇。 (B) t-SNE 表示显示不同的细胞类型，根据心脏中不同细胞 (心肌细胞、内皮细胞、心脏祖细胞、成纤维细胞、神经细胞和间充质) 的标记基因表达进行着色。 (C) 不同簇对应的多谱系类器官的比例。 (D) 心肌细胞簇 (CM) 和内皮细胞簇 (EC) 的顶级标记基因热图。 (E、F) t-SNE 表示显示心肌细胞簇和内皮细胞簇中标记基因的表达。 (G) 确认心肌细胞簇和内皮细胞簇的标记基因的小提琴图。 (H, I) 基因本体论 (GO) 分析显示根据心肌细胞簇和内皮细胞簇中的特征基因富集的生物学过程。将 FDR 调整后的p值 0.05 设置为阈值。

人类 vcCO 中的心肌细胞-内皮细胞相互作用分析

在人类vcCO中，心肌细胞和内皮细胞之间的相互作用分析表明，这两种细胞类型之间存在重要的细胞通讯网络。心肌细胞和内皮细胞之间的配体-受体对丰富表达，显示了它们之间的密切联系，主要涉及与血管生成和细胞外基质组织相关的生物过程和分子调控。进一步的GO和KEGG分析表明，在心肌细胞和内皮细胞之间的相互作用中，PI3K-AKT信号通路、ECM-受体相互作用信号通路和Ras信号通路显著上调（图3）。因此，可以推测这三条信号通路对于心肌细胞和内皮细胞之间的细胞通讯在vcCO中至关重要。

图 3 人类心室肌 (vcCO) 中的心肌细胞-内皮细胞相互作用分析。 (A) 基于 scRNA-seq 数据的配体-受体对分析推断的不同细胞群之间的相互作用网络。线的边缘宽度与指定的配体-受体对的数量成正比，圆圈的大小与每个细胞组中的单位数成正比。 (B) 热图显示不同簇之间显着的配体-受体相互作用（p值 < 0.05，置换检验）。蛋白质相互作用根据其 mRNA 水平推断。 (C) 不同细胞类型之间前 25 种配体-受体相互作用的概览。X 轴和 Y 轴分别表示细胞-细胞对和配体-受体对。每个气泡代表细胞-细胞对中的配体-受体对。 (D) 维恩图显示心肌细胞-内皮细胞 (CM/EC) 和内皮细胞-心肌细胞 (EC/CM) 方向配体-受体对的重叠。(E) 43 个重叠配体-受体对在生物过程、细胞成分和分子功能中的基因本体论 (GO) 分析。(F) 与重叠配体-受体对相关的 KEGG 通路。将 FDR 调整后的p值 0.05 设置为阈值。

多谱系人类 vcCO 模拟心肌损伤引起的纤维化

该研究对人类血管化和心室化心脏类器官（vcCO）进行了冷冻损伤，以模拟人类心肌梗死（MI）的过程。在人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为vcCO的第25天引入了冷冻损伤，并在第28天通过记录钙转换来评估功能变化。该研究还调查了卡托普利（CAP），一种FDA批准的用于MI管理的药物，在冷冻损伤vcCO上的潜在治疗效果。

结果显示，冷冻损伤导致vcCO内不同区域的心肌细胞异步收缩和钙处理能力受损。然而，CAP治疗能够改善异步收缩并促进vcCO从冷冻诱导的钙处理障碍中恢复（图4）。Masson三色染色结果显示冷冻损伤的vcCO明显纤维化，而CAP治疗有效预防了这种情况。此外，基因表达分析显示冷冻损伤的vcCO中纤维化标记基因增加，内皮和心肌标记基因减少，而CAP治疗逆转了这些效应。心脏肌钙蛋白T（cTnT）的释放（一种急性心脏损伤的血清标志物）在冷冻损伤的vcCO中升高，但受到CAP治疗的抑制。

以上研究表明，冷冻损伤的 vcCO 中 cTnT 的释放显著增加，而 CAP 对 cTnT 释放具有抑制作用。此外，冷冻损伤可以模拟缺乏其他细胞成分的心肌球中的急性心脏损伤，但vcCOs比心肌球更适合模拟MI的病理过程和评估药物疗效。

图 4 多谱系人类心脏血管样细胞 (vcCO) 模拟心肌损伤引起的纤维化。 (A) 用于建模和评估 vcCO 中冷冻诱导损伤的示意图。 (B) 有/无冷冻损伤和卡托普利 (CAP) 治疗的 vcCO 不同区域钙瞬变的一致性分析 ( n  = 5)。代表性图像显示了对照组 (Ctrl，红色轨迹)、冷冻损伤组 (Cryo，蓝色轨迹) 和冷冻损伤加 CAP 治疗组 (Cryo+CAP，绿色轨迹) 中钙活动和钙处理轨迹的延时记录。在显微镜下捕获图像之前，vcCO 中预装了钙指示剂 Fluo-4 AM。 (C、D) 对照组、冷冻损伤组和恢复组 vcCO 的 Ca 2+瞬变特性，包括 Ca 2+瞬变的幅度(C) 和达到峰值的时间 (D)。 (E) 冷冻损伤和恢复后的 3 天内 vcCO 的 Masson 三色染色（蓝色，结缔组织；红色，肌肉）。比例尺，100 微米。(F) 纤维化区域的量化。(G-I) 不同 vcCO 中成纤维细胞（α -SMA、VIM）、内皮细胞（CDH5、PECAM1）和心肌细胞（TNNT2、MYH7）标记基因的实时 PCR 分析（n  = 5）。(J) 通过 ELISA 评估培养基中的 cTnT 水平（n  = 10）。单因素方差分析；* p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001；ns，不显著。

多谱系人类 vcCO 作为药物毒性检测平台

该研究探讨了多谱系人类 vcCO在药物毒性分析方面的潜力，特别是针对具有心脏毒性的化疗药物多柔比星（DOX）。实验结果显示，DOX治疗显著减少了vcCO的跳动频率，并呈剂量和时间依赖性。高剂量DOX几乎完全抑制了vcCO的跳动，并降低了其细胞存活率，表现为剂量和时间依赖性的细胞存活抑制（图5）。同时，DOX处理的vcCO中细胞凋亡增加，与TUNEL实验的结果一致。进一步的分析显示，DOX处理后的vcCO钙处理能力受损，表现为峰值幅度降低和时间延长。这些发现表明，人类vcCO为临床前药物心脏毒性分析提供了有效的体外模型。

图 5 多谱系人类心脏血管样细胞 (vcCO) 作为药物毒性测定平台。 (A, B) 阿霉素 (DOX) 对 vcCO 跳动频率 (A) 和跳动类器官比例 (B) 的剂量和时间依赖性影响。心脏类器官分别与不同剂量的 DOX (0、0.1、1、10 和 50 μM) 孵育 24、48 和 72 小时 ( n  = 5)。与 0 小时相比，* p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001 和 ns，不显著。 (C) 用 DOX 处理 24、48 或 72 小时后对 vcCO 的 CCK8 测定结果 ( n  = 5)。 (D) 阿霉素处理后 vcCO 中的 ATP 水平 ( n  = 5)。 (E) 在多谱系人类 vcCO（n  = 5）中 Annexin V-FITC 染色后对荧光强度进行定量分析。与相同浓度的 24 小时相比，* p  < 0.05、** p  < 0.01、*** p  < 0.001 和 ns，不显著。(F, G) 在所示浓度下暴露于 DOX 48 小时后，类器官切片的凋亡染色 (TUNEL)。(H) 代表性图像显示了预装钙指示剂 Fluo-4 AM 的对照 (Ctrl，蓝色轨迹) 和 DOX 处理 (绿色和黄色轨迹) vcCO 的钙活动和钙处理轨迹的延时记录。(I, J) 对照和 DOX 处理的 vcCO 的 Ca 2+瞬变特性，包括 Ca 2+瞬变的幅度(I)、达到峰值的时间 (J)。单因素方差分析； * p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001，且 ns 不显著。

结论

本研究的亮点在于：

提供了一种新的方法：建立了人类诱导多能干细胞衍生的心脏类器官（CO）作为药物毒性评估模型，为评估药物对心脏的毒性提供了新的体外模型。

拓展了研究领域：通过研究多柔比星（DOX）对CO的影响，展示了CO在药物评估中的潜力，为心血管疾病研究提供了新的研究途径。

促进了药物研发：通过使用CO作为模型，可以更有效地评估药物对心脏的毒性，有助于提高药物研发的效率和安全性。

总之，本研究为药物毒性评估提供了新的模型，有助于深入了解药物对心脏的影响，推动心血管疾病研究和药物开发领域的进展。

参考文献：

Yang J, Lei W, Xiao Y, et al. Generation of human vascularized and chambered cardiac organoids for cardiac disease modelling and drug evaluation. Cell Prolif. Published online March 7, 2024. doi:10.1111/cpr.13631

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