2024年1月2日，中南大学湘雅医院内分泌研究中心罗湘杭和周海燕教授团队，在Nature Communications上发表了题为“Myeloid-derived grancalcin instigates obesity-induced insulin resistance and metabolic inflammation in male mice”的研究文章，苏甜为第一作者。
发表期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
发表世界：2024年01月
研究材料：HFD饲喂小鼠 vs NCD饲喂小鼠的骨髓用于单细胞测序
研究方法：10x Genomics单细胞转录组测序；
文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43787-x
欧易生物助力了该项目的单细胞转录组测序实验和分析工作
由于生活方式和饮食的改变，肥胖变得越来越普遍，而肥胖诱导的炎症是许多代谢性疾病的重要致病介质。因此，迫切需要确定影响脂肪组织炎症的关键因素。
衰老和肥胖具有与慢性低度炎症状态相关的共同生物学特征，此外，肥胖还加速了衰老的过程。作者在之前的研究中发现在衰老过程中促炎免疫细胞包括中性粒细胞等，会分泌颗粒钙素（GCA）影响BMSC的命运。因此，作者推测骨髓来源的GCA可能也参与了肥胖患者的脂肪组织炎症和胰岛素抵抗。
本研究采用单细胞RNA测序研究正常饲喂（NCD）的对照小鼠和高脂肪饮食诱导（HFD）的肥胖小鼠骨髓单细胞图谱及转录组的差异。基于scRNA-seq探究HFD诱导过程中组织分泌GCA的细胞，找到了中性粒细胞为表达该基因的主要细胞群，并通过单细胞测序着重描绘了骨髓中中性粒细胞的亚型特征。通过GCA+中性粒细胞与GCA-中性粒细胞的转录差异比较，发现炎症相关基因在GCA+细胞群中表达升高，提示GCA与炎症的相关性。通过构建各类模型小鼠，逐步揭示了GCA在肥胖诱导过程中与脂肪组织炎症和胰岛素抵抗的相关性。
综上，本研究揭示了骨髓GCA启动脂肪组织炎症和胰岛素抵抗的机制，表明GCA可能是治疗组织炎症的潜在靶点。
1. 肥胖诱导骨髓中GCA+免疫细胞的动态增加
为了评估GCA表达与肥胖的相关性，作者检测了骨髓中GCA的表达水平：与相应的对照组相比，高脂肪饮食诱导（HFD）的肥胖组和ob/ob组小鼠骨髓中GCA的mRNA和蛋白水平免疫荧光升高（图1a,b）。
由于GCA是一种分泌蛋白，作者进一步分离了暴露于正常饲料（NCD）、1周HFD、2周HFD、4周HFD、8周HFD和12周HFD的雄性小鼠的血清，以检测循环中的GCA浓度，发现在HFD诱导的过程中，GCA保持动态增加。基于以上实验，了解到在HFD喂养过程中GCA水平确实有所升高。但目前尚不清楚在这一过程中具体哪些细胞分泌GCA，因此，作者对HFD和NCD小鼠的骨髓进行了单细胞RNA测序。
作者发现GCA主要在中性粒细胞中表达。与NCD组相比，HFD小鼠骨髓中GCA+中性粒细胞的数量更多（图1d）。此外，与GCA-中性粒细胞相比，GCA+中性粒细胞炎症和免疫相关基因表达更高。为了进一步表征GCA+中性粒细胞，作者对骨髓中性粒细胞进行了亚群分析：结果显示中性粒细胞进一步分为了8个不同的cluster，在HFD小鼠中Cluster1、2和3含有更多的GCA+中性粒细胞（图1e）。因此，作者进一步分析了这3个cluster的转录谱，发现炎症相关基因：Il1b、Fgl2、Ifitm1、Pla2g7、Ptgs2等基因表达升高（图1f）。这些数据表明，GCA+中性粒细胞在HFD诱导后增加，并表达高水平的促炎症相关基因。
图1 肥胖诱导骨髓中颗粒钙素+（GCA +）免疫细胞的动态增加
2. 髓系细胞中GCA的敲除改善了脂肪组织炎症和糖代谢
基于以上实验，揭示了GCA和肥胖存在潜在联系，且髓系细胞与GCA有一定关系。作者接下来设计实验删除了髓系细胞中的GCA，探究其对脂肪组织代谢的影响。对基因敲除小鼠及其相应的对照小鼠用HFD诱导12周，可以观察到与WT鼠相比，基因敲除小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数都较低（图2b-d）。葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）的结果也显示基因敲除后，小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性有所改善（图2e-i）
此外，作者观察到用HFD喂养的基因敲除小鼠eWAT基质血管分数（SVF）中促炎Th1标记基因Tbx21和Ifng的表达降低，抗炎Th2（Gata3）和Treg（Foxp3）标记基因的表达升高（图2p）。流式细胞术分析进一步证实了基因敲除小鼠SVF中Th1细胞比例降低，Treg细胞比例升高，表明基因敲除后，脂肪组织中的促炎T细胞活化减少。这些数据综合表明，GCA在肥胖诱导的炎症和胰岛素抵抗中发挥了重要作用。
图2 髓系中GCA的缺乏可改善脂肪组织的炎症和葡萄糖代谢
3. GCA在体内加剧脂肪组织炎症、胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良；在体外加剧脂肪细胞的炎症反应
为了探讨GCA是否足以诱导WAT产生炎症，作者对雄性C57BL/6小鼠注射了重组GCA。与注射PBS的WT小鼠相比，GCA处理小鼠的eWAT和肝脏中炎症细胞因子基因表达水平升高（图3a），且eWAT中含有更多的M1巨噬细胞（图3b）。QPCR分析检测到GCA处理小鼠SVF中促炎Th1标记基因表达水平升高（图3c）。
图3 GCA加重了小鼠脂肪组织炎症
随着炎症反应的增加，GCA处理小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和HOMAIR指数均有所升高，且表现出葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗（图4e-k）。这些综合数据表明，GCA可引发脂肪组织炎症并加速代谢失衡。
图4 GCA加重了HFD喂养小鼠的脂肪组织炎症、胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良
基于文献报道结合前期实验结果，作者推测GCA可能通过作用脂肪细胞引发脂肪炎症。为了研究GCA对体外脂肪细胞功能的影响，作者将小鼠原代前脂肪细胞或3T3-L1脂肪细胞与不同浓度的GCA孵育，发现GCA孵育对脂肪细胞分化没有影响。QPCR分析显示，在小鼠原代脂肪细胞和3T3-L1脂肪细胞中，Ccl2、Il1b、Il6、Tnfa的表达均呈GCA浓度依赖性增强（图5a-d）。此外，作者还发现GCA处理诱导了体外脂肪细胞MHCII家族基因的表达，并激活了Th1细胞产生（图5m,n）。综上这些数据表明GCA诱导脂肪细胞中炎症因子的表达，进而激活促炎Th1细胞放大炎症。
图5 GCA在体外放大了脂肪细胞的炎症反应
4. PHB2是脂肪细胞中GCA的功能受体
为了鉴定脂肪细胞中GCA的功能细胞表面受体，作者将从分化的3T3-L1脂肪细胞的细胞膜中分离出来的蛋白与His标记的GCA进行孵育，然后对GCA拉下的蛋白质进行质谱分析。一共鉴定出289个与GCA结合的膜蛋白，作者将研究重点放在PHB2（图6a）上，且通过实验验证了体外GCA与PHB2存在直接结合（图6b-d）。
为了进一步确定GCA与PHB2结合的结构域，作者根据不同的结构域位置构建了一系列缺失突变体。出乎意料的是，PHB2中任何一个结构域的缺失都不影响与GCA的结合（图6e,f）。作者推测可能是GCA同时结合PHB2的多个结构域，而一个结构域的缺失对其结合影响不大。
为了证明GCA通过PHB2放大脂肪细胞的炎症，作者构建了脂肪细胞特异性PHB2敲除小鼠（Phb2- CKD小鼠）。用HFD持续诱导Phb2-CKD小鼠和对照组小鼠 8周，同时给予GCA或PBS处理。与预期的一样，GCA促进了eWAT中炎症标志物的表达（图6g）。此外，GCA处理小鼠巨噬细胞浸润和M1极化增加（图6h），而Phb2敲除则消除了GCA的促炎功能（图6g,h），并减轻了GCA处理小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受不良（图6i-o）。综上所述，这些结果表明PHB2是脂肪细胞中GCA的功能受体。
图6 PHB2是脂肪细胞中GCA的功能受体
5. GCA中和抗体改善了肥胖小鼠的脂肪组织炎症和胰岛素敏感性
Anti-GCA单克隆抗体在阻断GCA的作用方面效率最高，因此作者探索了anti-GCA中和抗体对代谢性炎症的影响。对DIO小鼠用不同剂量的GCA中和抗体（GCA-NAb）经尾静脉注射治疗，每周注射2次，连续2个月。低浓度GCA-NAb对eWAT、肝脏和脂肪细胞中炎症细胞因子的基因表达水平无明显影响（图7a-c）。中、高浓度GCA-NAb处理的小鼠在eWAT、肝脏和脂肪细胞中炎症细胞因子基因的表达水平较低（图7a-c）。这些数据表明，GCA中和抗体能改善肥胖小鼠的脂肪组织炎症和胰岛素敏感性。
图7 GCA中和抗体（GCA-NAb）可改善肥胖小鼠的脂肪组织炎症和胰岛素敏感性
1. GCA+免疫细胞在肥胖过程中积累，并有大量的GCA被释放到循环中。
2. 基于scRNA-seq技术描绘了正常饲喂（NCD）的对照小鼠和高脂肪饮食诱导（HFD）的肥胖小鼠骨髓中性粒细胞亚群图谱及GCA+中性粒亚群转录信息。
3. 髓系细胞中GCA基因缺失可减轻肥胖雄性小鼠的代谢功能障碍。
4. GCA与脂肪细胞上的抑制素-2（PHB2）受体结合。
5. GCA中和抗体改善了肥胖雄性小鼠的脂肪组织炎症和胰岛素敏感性。
参考文献：
Su, T., He, Y., Huang, Y. et al. Myeloid-derived grancalcin instigates obesity-induced insulin resistance and metabolic inflammation in male mice. Nat Commun 15, 97 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43787-x
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