利用神经示踪工具实现对神经环路的精确标记，主要涉及两大基本问题即方向性（顺向、逆向）和是否跨突触。顺向(Anterograde)是由注射部位的神经元胞体经轴突下行至末梢，逆向(Retrograde)则是由轴突末梢传到细胞体；顺向跨突触是从胞体传到轴突末梢后跨过突触传递至下一级神经元，逆向跨突触跟顺向跨突触相反，是由胞体逆向跨突触传递至上一级神经元的轴突。如下图所示：

（Strick P L，et al.，eLS，2011）

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是目前已发现的结构最简单的一类单链DNA复制缺陷型病毒，具有安全性高、免疫原性低、宿主细胞范围广和在体内表达时间长等特点。科学界现普遍认为AAV不会导致人类疾病，因此是目前最有前景的基因治疗载体。

基因工程化的AAV能转导外源基因，借助特定启动子、光遗传学/化学遗传学元件、钙指示剂、神经递质探针或Cre/lox P，Flp／FRT重组酶技术，可选择性地标记特定的神经元。越来越多的神经环路研究使用AAV作为神经示踪工具。

AAV血清型种类多，不同的血清型对神经元有不同的感染特性。神经科学研究中常用的 AAV 血清型有 2、5、8、9、DJ、1/2、PHP、Anc80等，它们有高效转导神经元的能力，可根据标记的神经元选择合适的AAV血清型。常见的 AAV 病毒载体都是顺向标记，极少能进行逆行传递，这大大限制了 AAV 载体在神经环路示踪中的应用。直到 2016 年，研究人员在 AAV2 的基础上，通过定向进化的方式改造出一种具有逆向示踪功能的 AAV2 突变体——AAV2-retro，该载体能够在小鼠大脑中进行有效的神经环路逆向标记，且其逆行示踪能力和效率与传统的逆行示踪剂相当。下图所示为 rAAV2-retro 的开发过程及应用实例：

rAAV2-retro（逆向非跨突触标记） （Tervo et al., Neuron, 2016）