在进行蛋白与小分子亲和力检测时，采用表面等离子共振技术等基于分子间结合引起的质量变化原理进行亲和力检测时，可能会遇到样品分子量低（分子量低于200）或与目标蛋白分子量差异大（与蛋白分子量差异大于100倍）导致检测信号低，以及蛋白难以达到理论上所需的固定量等实验难优化的问题。
微量热泳动技术（MST）基于小分子与蛋白结合导致的分子构象、大小、电荷、水化层的变化进行亲和力检测。MST技术对检测的小分子的分子量下限没有限制，即便是离子与蛋白的互作也能轻松检测，同时也不受蛋白与小分子的分子量比值的限制，可以轻松检测蛋白与小分子及离子的相互作用。MST技术无需将蛋白固定在固相载体上，可以更好的保持蛋白的天然构象，利于进行膜蛋白分子互作实验。
2019年上海科技大学免疫化学研究所饶子和院士与杨海涛教授团队在Cell期刊发表该文章Crystal Structures of Membrane Transporter MmpL3, an Anti-TB Drug Target. Cell。解析了结核分枝杆菌（M. smegmatis）MmpL3以及其和四种抑制剂药物的复合物的晶体结构。这篇文章中研究者利用MST技术检测了膜蛋白MmpL3及其突变体与四种抑制剂(SQ109、AU1235、ICA38和rimonabant)的结合亲和力常数。
图1.文章摘要
结核分枝杆菌是引发严重传染病——结核病TB的元凶。近年来，科学家致力于发掘新的TB药物靶点，开发新的抑制剂来攻破TB。MmpL (Mycobacterial membrane protein Large) 是分枝杆菌基因组编码的一组膜蛋白，在细菌耐药性中发挥重要作用。其中，MmpL3调控细胞复制和存活，降低MmpL3的表达可以有效阻止细胞分裂并导致细胞迅速死亡。文章中首先解析了完整的MmpL3晶体结构：PN和PC结构域为其胞外可溶区(胞质孔状结构域),TMN和TMC为跨膜结构域共包含12个跨膜螺旋。
图2.Mycobacterium smegmatis编码的MmpL3的整体结构
随后通过利用MST分别检测MmpL3及其突变体与四种抑制剂(SQ109、AU1235、ICA38和rimonabant)的结合亲和力常数，确定抑制剂的功效。结果显示：四种抑制剂解离平衡常数（KD值）分别是是1.65 uM, 0.3 uM, 0.16 uM和29 uM。
图3.MmpL3及其突变体与抑制剂SQ109, AU1235, ICA38和rimonabant的结合亲和力常数测定
Microscale thermophoresis assay
Binding affinities of SQ109, AU1235, ICA38 and rimonabant with the purified wild-type and MmpL3 mutants were measured by using the Monolith NT.115 (Nanotemper Technologies). The proteins were fluorescently labeled according to the manufacturer’s procedure and kept in the MST buffer (20 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) DDM) at a concentration of 200 nM. Next, the RED fluorescent dye NT-647 was added, mixed and incubated for 30 min at 25°C in the dark. For each assay, the labeled protein was mixed with the same volume of unlabeled inhibitor (SQ109, AU1235, ICA38 or rimonabant) at 16 different serially diluted concentrations at room temperature. The samples were then loaded into premium capillaries (NanoTemper Technologies) and measured at 25°C by using 40% LED power and medium MST power. Each assay was repeated three times. Data analyses were performed using MO. Affinity Analysis v.2.2.4 software. There is 95% confidence, that the Kd value is within the given range. All figures were made by GraphPad Prism 5.0.
为了进一步确认蛋白和抑制剂的作用模式，解析了MmpL3和四种抑制剂药物的复合物的晶体结构。结果发现四种抑制剂SQ109、AU1235、ICA38和rimonabant，都有着结构类似的药物结合口袋。这种药物结合的结构特点，对于抑制MmpL3这一靶点蛋白的抗结核药物设计具有非常重要的指导作用。
图4. AU1235、ICA38及SQ109的结合位点
原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30036-4
