乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染是中国肝癌人群的主要致病因素。虽然肝癌中HBV整合事件早有报道，但其整合特征、整合机制以及HBV整合引起的基因组变异如何影响肝癌发生仍不十分清楚。近期，Nature报道了一项针对中国肝癌人群的大规模、高深度全基因组测序研究，聚焦解析基因组亚克隆结构和聚集式变异事件。
近日，中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科赵宏/蔡建强教授团队、天津医科大学肿瘤医院鲍莉教授团队、中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室焦宇辰教授团队于Gut杂志在线发表了题为HBV integrations reshaping genomic structures promote hepatocellular carcinoma的论文，全面揭示了中国肝癌人群HBV整合特征、整合机制以及HBV非典型整合导致chr8q24扩增促进HCC发生的机制。
研究者首先基于全基因组二代测序和单分子长读长三代测序数据，全面重建了HBV整合的基因组图谱，发现不同于发生在几个热点基因（TERT、CCNE1和MLL4）上的HBV整合，大部分分散在整个基因组中的其他HBV整合通过引发基因组重排和拷贝数变异，而发挥致癌作用。。通过分析每个HBV整合事件的基因组结构，归类出5种HBV整合亚型，即1种经典整合和4种非典型整合；5种整合亚型在染色体上具有不同的分布偏好，且分别导致染色体发生不同类型的畸变。通过分析不同年龄肝癌患者的基因组结构，发现青年肝癌（<35岁）样本中几乎不存在肝癌常见的激活驱动突变 (TERT，CTNNB1)，但却显著富集HBV非典型整合，说明青年肝癌和非青年肝癌具有不同的致癌机制。进一步的分析发现HBV整合由双链断裂修复（DSB）机制介导，并且同一个整合事件可能存在2种不同的DSB修复机制参与。最后，研究者利用CRISPR激活筛选技术，通过体内外实验模拟了HBV非典型整合引起的chr8q24超早期扩增在HCC发生中的作用，发现chr8q24扩增中除MYC之外，TMEM65和TONSL也可诱导小鼠成瘤。其中TMEM65主要通过激活糖酵解和血管生成通路发挥致癌作用。
使用全基因组测序（WGS）分析HCC患者的肿瘤DNA样本（n=100），鉴定出其中的小突变和染色体结构变异（SVs）。在62%的病例中，证实了TP53中的突变和SVs，TP53是突变频率最高的基因。同时，热点突变（C228T和C250T）也积累在TERT启动子（n=21）上。此外，AXIN1（n=31）、CTNNB1（n=13）、ARID1A（n=11）、RB1（n=9）和SETD2（n=8）基因也发生了改变。染色体臂1q、5p、6p、8q、17q和20q的复发性增加与TCGA HCC数据集一致，而杂合性的丢失主要与染色体臂1p、4q、8p、9p、13q、16q和17p有关。
使用不同基因型（A、B、C、D、E、F、G和H）的参考HBV基因组，确定HBV基因型。在所有样本中，87例HBV DNA阳性，基因型C（n=84）和B（n=13）是主要类型（图1A）。进一步研究HBV的整合，在84个临床样本中总共鉴定出482个HBV整合，每个样本的中位数为5，其中88.8%在去除重复后至少有8个读数支持。在对影响编码基因的外显子（1.9%）、内含子（26.8%）和上游基因组区域（<10kb）（5.8%）的HBV整合进行分析时，发现TERT（n=28）、MLL4（n=7）、CCNE1（n=2）和TSHZ2（n=2）为复发基因位点，与以前的研究一致。
图1. 100例HCC中HBV感染和整合的概述（引自Gut）
使用第三代测序（ONT）分析50个肿瘤样本，确定了298个整合位点。在26个同时采用下一代测序（NGS）和ONT方法测序的样本中，91.2%（134/147）的总整合位点得到了两个平台的读数支持。基于收集的长读数（中位数≈10kb）获得了整合HBV DNA的全长，并将整合位点成对匹配。系统地研究了154个此类事件，包括的两个整合位点的相对位置、链方向和相邻的拷贝数概况。有趣的是，27个类似事件以折叠反转的形式存在，具有2个相同的宿主-病毒连接位点以及长对称回文HBV序列的整合（图2A）。这两个断点无法通过Illumina的读取结果进行区分，因此在NGS分析中仅计数一次。
总共描述了5种类型的整合事件（图2A）。I型事件共30个，均为α -β对，符合典型模式。根据非典型整合的定义，已确定的其他整合类型包括较大的重复（II型），倒置融合（IIIa和IIIb型）和远隔易位（IV型）（图2A和C）。一个β–α整合对包含10个II型事件，β位点位于α位点的上游（2.7kb至1.6Mb）。从β到α的基因组区域被复制（图2B），并且HBV DNA被插入到两个复制拷贝之间（图2A）。如上所述，IIIa型（n=27）由于两个等位基因染色体的折叠反转而具有两个相同的整合位点（图2A），而IIIb型（n=27）虽然也是折叠反转，但与IIIa型的区别在于有两个不同的断点和一个非回文插入的HBV序列，即之间有一个α-α对或β -β对，其距离可达3 Mbp（图2A和B）。两种类型（IIIa和IIIb）都会导致一侧或两侧的拷贝数增加或减少（图2A）。IV型（n=59）融合了两个不同的（距离>10 Mb）宿主染色体区域，类似的远隔易位，并且大多数是染色体间事件（91.5%，54/59），导致宿主基因组大规模增加或减少（图2A）。总体而言，这一分析揭示了更广泛的整合事件。
图2. 通过第三代测序检测到五类整合（引自Gut）
非典型（II-V型）整合诱导了TERT（n=16）、CCNE1（n=2）、CCND1（n=2）和MLL4（n=1）中的基因扩增，并伴有chr17p丢失和TP53缺失（n=15），这主要是由IV型整合引起的。整合诱导的CNVs也在整个基因组中大范围发生，除了chr5和chr17中的CNVs外，还经常引起chr8q（n=14）、19q13.42（n=7）、1q（n=6）、7p（n=4）、6p（n=4）和20q13.3（n=4）的应用，以及chr8p（n=11）、4q（n=11）、16q（n=8）、6q（n=7）、9p（n=6）、13q（n=6）和1p（n=5）的缺失。重要的是，这种基因组改变在HCC中似乎普遍存在，并且包含关键的肿瘤驱动基因，例如ARID1A、CDKN2A和RB1。研究者重建了可能导致chr8q整合诱导扩增的进化场景，并将扩增前后钟样突变（COSMIC SBS标签1和5）数量的变化作为计时的参考。大多数扩增（7/8）可能发生在临床诊断之前的数十年，甚至出现在患者一生中的超早期（<10岁）（5/8）。
进一步比较TCGA HCC样本（n=361）中HBsAg阳性组（n=106）和HBsAg阴性组（n=245）的拷贝数变异（CNVs），以研究HBV诱导的CNVs在HBV+HCC中是否过度表达。结果显示，HBsAg+样本的chr8q扩增和chr4q、chr16q和chr17p缺失频率显著更高（p<0.02），这些属于HBV诱导的CNVs的最高级别。此外，将研究中的124个HCC与221个HCC浅WGS测序数据的新队列相结合，并比较了HBsAg+（n=248）和HBsAg-（n=97）样本之间的CNV谱。尽管存在一些差异，但结果与TCGA分析的相似，即观察到chr8q扩增富集，以及chr4q、chr16q和chr17p缺失，这表明整合相关CNVs在HBV阳性HCC中发挥作用。
招募的患者中有相当一部分（54/124）年龄在35岁以下，这使得我们能够建立患者年龄与非典型整合频率之间的负相关（p<10-5）；相比典型整合，非典型整合可能在年轻患者中发挥特定的致癌作用，加速肿瘤发生（p>0.05）。较高水平的HBV DNA载量和TP53突变与非典型整合的数量显著相关（p<10-5；学生t检验），而非典型整合（p>0.05），这表明基因组不稳定性和细胞内游离HBV DNA的浓度决定了非典型整合的发生率。此外，在既往主动接受抗病毒治疗（p=0.055，Wilcoxon秩和检验）或HBeAg评分阴性（p=0.022，Wilcoxon秩和检验）的患者中，证实的整合较少，这凸显了感染控制和抗病毒治疗在降低病原性HBV整合和HCC风险方面的重要性。研究未观察到预后与典型或非典型整合数量之间的显著相关性。然而，这些整合的HBV DNA是人类细胞的外源性DNA，常与驱动基因的激活有关（如TERT），其可能成为最先进技术（如CRISPR）应用的治疗靶点。
4、体内CRISPRa筛选确定TONSL和TMEM65可促进肝癌发生
chr8q上HBV整合位点扩增的基因可能在HCC进展的超早期阶段发挥重要作用。因此，在免疫抑制小鼠中不致瘤的小鼠胚胎肝细胞BNL-CL.2,35中进行了基于CRISPR的功能获得性遗传筛选，以研究通过HBV整合在chr8q的常见扩增区域中确定的候选基因的作用。HBV整合在chr8q常见扩增区域中鉴定的候选基因的作用。使用了一个鼠慢病毒文库，其中包含388个sgRNA，靶向chr8q中的55个扩增候选物和其他染色体中的3个（Ccnd1、Ccne1或Tert），以及10%的非靶向对照（NTC）。
将转化的BNL-CL.2细胞（表达dCas9-VP64）进行3D培养2周，然后皮下植入免疫缺陷的受体小鼠。在移植后第8周收集移植物，用于sgRNA丰度评估和组织病理学检查。重要的是，这些移植物产生了让人联想到人类HCC的组织学特征，例如轮廓不规则、核质比高，以及频繁的有丝分裂和凋亡图，这些特征也通过相应的功能标志物进行了验证，包括用于早期HCC标志物的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Gpc3），用于肝细胞分化的细胞角蛋白8（Ck8）和用于增殖的Ki-67。在所有筛选的基因中，发现Tmem65、Tonsl和Myc是最佳候选基因。
然后，使用CRISPRa系统通过单独激活三个顶级候选物来生成模拟相应致病性遗传改变的BNL-CL.2系。3D生长2周后，将指定的细胞系和NTC细胞皮下移植到免疫抑制小鼠中，之后开始监测肿瘤形成。在第44天，与其他组相反，所有植入了1×106个Tonsl-激活（n=3）和Tmem65-激活（n=3）细胞的小鼠都出现了可检测到的肿瘤肿块。在第50天，移植细胞较少（5×104）的小鼠也出现了可检测到的肿瘤肿块（图5E和F）。值得注意的是，Tonsl-激活和Tmem65-激活的肿瘤均显示出恶性HCC的典型的组织学和病理学特征（图5G）。然而，直到研究终点，在植入Myc-激活细胞或NTC组的小鼠中未观察到显著的肿瘤发展。使用单细胞RNA测序，分析了原始的BNL-CL:2细胞系和4个CRISPRa编辑的BNL-CL.2移植肿瘤（两个Tonsl-激活和两个Tmen65-激活）。利用基因组snp验证单细胞来源，所有肝细胞均符合细胞系谱系，所有微环境细胞均符合小鼠谱系。我们推测5个样本中所有肝细胞均存在CNVs，但未观察到显著的CNVs和亚克隆。
接下来，研究了Tonsl和Tmem65蛋白是否可以转化通常用于分析致癌潜力的NIH/3T3小鼠成纤维细胞和另一种小鼠肝细胞AML-12。为此，用含有Tonsl、Tmem65和Myc的慢病毒分别转导NIH/3T3和AML-12细胞，已知其具有转化潜力。qRT-PCR和免疫印迹分析显示，转导的细胞稳定表达Tonsl、Tmem65或Myc。与模拟对照组相比，所有转导的NIH/3T3细胞的集落形成均增加。将这些转导的细胞接种到裸鼠的胁腹，以确认体内的转化能力。NIH/3T3实验中，Tonsl组、Tmem65组和Myc组的所有裸鼠均发生了皮下肿瘤。相比之下，模拟转导的细胞显示出较弱的致瘤性，表现为肿瘤大小和重量的显著减小。进一步的组织病理学分析显示，在Tonsl、Tmem65和Myc的NIH/3T3移植物中，腺瘤和癌肿瘤特征与模拟物相反（图5M）。对于AML-12，从第55天开始可检测到具有Myc过表达（n=7）的肿瘤肿块，并且到第76天体积达到500 mm3。从第97天开始到第104天，更多的小鼠出现了可见的皮下肿瘤，其中Tmem65（7/7）或Tonsl（4/7）过表达。到第118天，所有剩余的小鼠（3/7）都出现了Tonsl过表达的可见皮下肿瘤，而对照组中的所有小鼠（n=7）仍然没有肿瘤。所有发生的肿瘤均被定性为HCC。这些发现表明，Tonsl和Tmem65的激活或过表达引起小鼠的癌变。
研究者测序并比较了12个NIH/3T3同种异体移植肿瘤的转录组（3个NTC，3个Myc过表达，3个Tonsl过表达和3个Tmem65过表达），共鉴定出444个不同表达的基因（q<0.1），并将其分为5个簇。Tmem65过表达上调的基因聚集成簇1；Tmem65和Myc的过表达导致簇2基因表达下调，簇5基因表达下调更为显著；簇3包括Myc过表达后下调的基因；基因簇4表现为Tonsl和Myc活性增强，Tmem65活性增强程度较低。
簇1富集了包括糖酵解（p<10-10）、TGFB1靶点（p<10-9）、缺氧（p<10-8）和血管生成（p<10-4）在内的通路的系统性重编程，显示Tmem65与缺氧反应密切相关。簇1涉及催化糖酵解的典型10个步骤和进一步的下游程序的酶，包括Tpi1（步骤5）、Pgk1（步骤7），Pgam1（步骤8）、Eno1（步骤9）、Pkm（步骤10）、Pdk1和Ldha。其他糖酵解酶，包括Gpi1（步骤2；p=0.0066）、Fpkl（步骤3；p=0.0057）和Gapdh（步骤6；p=0.022），虽然没有那么显著（0.1<q<1），但也可以扩展到Tmem65过表达引起的上调基因。重要的是，Pkd1和Ldha通过阻断丙酮酸进入三羧酸循环来促进厌氧糖酵解和抑制有氧糖酵解。此外，簇1涉及血管生成因子Pdgfa和细胞氧感受器Egln1和Egln3，其催化缺氧诱导因子α（HIF-α）蛋白的转录后修饰。簇3富含炎症反应（p<10-6）。相比之下，簇2和簇5富含与上皮-间质转化（EMT）密切相关的细胞外基质结构（p<10-10），表明Myc和Tmem65过表达对EMT的潜在作用。以凋亡调节因子Bcl2l1（bcl-X）和细胞周期控制因子E2f1（图6A）为特征的簇4，更多地参与细胞死亡和凋亡过程的调节（p<10-5）。
通过分析上述建立的AML-12同种异体移植的转录组，进一步验证了这些结果。在Tmem65过表达时，除参与缺氧反应的基因如Hif1a和参与血管生成的基因如Pdgfa和Vegfa外，一系列编码糖酵解酶的基因如Eno1、Pgk1、Pgam1、Tpi1和Pkm的表达显著增加。相反，Tonsl过表达增强了Bcl2l1的表达。对BNLCL.2来源的同种异体移植物进行的单细胞分析获得了类似结果。与Tonsl激活和原始BNL-CL.2相比，Tmem65激活的肿瘤细胞中Eno1、Pgk1、Pgam1、Ldha和Pdgfa的上调程度更高（p<10-4），而Tonsl主要在循环肝细胞中表达。对于癌症标志性通路，研究发现Tmem65激活特别增强了血管生成、缺氧、糖酵解和EMT（p<10-10）。相比之下，Tonsl激活的同种异体移植物的循环肝细胞，G2M检查点和E2F靶点的表达上调且比例翻倍（6.7% vs. 3.5%），这符合Tonsl和Tmem65的功能分析，Tonsl在DNA复制过程中维持基因组稳定性，而Tmem65调节线粒体动力学。
对TCGA泛癌数据的分析表明，除HCC外，Tmem65和Tonsl在大多数癌症类型中均上调。覆盖Tmem65、Tonsl和Myc位点的chr8q24扩增在不同癌症类型中普遍存在，突显了Tmem65和Tonsl失调对一般肿瘤发生的潜在作用。然而，Tonsl而非Tmem65的表达与HCC中的肿瘤大小相关。在TCGA HCC中，Tonsl和Tmem65的表达均可预测不良预后。进一步研究含有363个具有生存信息的新HCC样本的组织微阵列中Tonsl的表达，再次发现较高的TONSL表达与较差的总生存期密切相关。
总之，该研究证实HBV整合广泛重塑基因组结构并促进肝癌形成，而这可能在患者生命的早期就已经发生。研究所揭示的HBV整合所导致的基因组不稳定性机制，可以为致病性病毒感染与相关肿瘤发生之间的关系提供更多的见解。此外，研究者在慢性HBV感染、chr8q扩增和肝癌发生之间建立的新功能联系可能有助于肝癌的预防和治疗。
中国医学科学院肿瘤医院赵宏教授、天津医科大学肿瘤医院鲍莉教授、中国医学科学院肿瘤医院焦宇辰教授、中国医学科学院肿瘤医院蔡建强教授为论文通讯作者。中国医学科学院肿瘤医院钱朝阳, 中国医学科学院基础医学研究所梁俊波副研究员、博士后黄容、宋伟研究员，中国医学科学院肿瘤医院应建明教授为论文共同第一作者。
https://gut.bmj.com/content/early/2024/02/23/gutjnl-2023-330414
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