肠内分泌细胞是一类分泌激素和神经肽的细胞，它们在调节代谢活动、胃肠分泌和运动等方面发挥着重要作用。然而，肠内分泌细胞的分化机制仍不完全清楚。最近，Hans Clevers 团队的一项研究发现ZNF800作为肠内分泌细胞分化的主要抑制因子，通过抑制PAX4的表达来调节肠内分泌细胞的分化，特别是限制肠内色素细胞的分化。

该研究成功地应用了人类器官进行CRISPR功能性筛选，这不仅标志着在生物科技领域取得了重要进展，更为深入探索人类肠道生理和病理中的其他调控因子奠定了坚实基础。这一研究成果有望为人类健康领域的发展带来新的突破。

文章介绍

题目：无偏转录因子CRISPR筛选确定ZNF800是肠内分泌分化的主抑制因子

杂志：Science

影响因子：IF=56.8978

发表时间：2023年10月

#1

研究背景

Background

肠内分泌细胞（EECs）是分泌激素的肠道上皮细胞，调节着代谢活动的各个方面，包括胰岛素水平、饱腹感、胃肠分泌和运动。过去使用RNA测序和类器官技术揭示了EEC发育过程中基因表达谱的时间层次结构。然而，关于NEUROG3上游的调控机制以及控制成年阶段NEUROG3表达的内源性抑制因子仍然大部分未知。本研究旨在建立一个基于类器官的平台，结合高通量基因筛选，发现调控人类EEC命运的转录因子。

#2

研究思路

Methods

使用一个包含7210个向导RNA（sgRNA）的CRISPR敲除文库，靶向1800个人类转录因子（TF）进行敲除。

通过特定报告基因标记EEC、杯状细胞和泌涎细胞的类器官。

在小肠类器官中进行了慢病毒介导的文库整合。

在类器官分化后，分析EEC和杯状细胞的分离。

在EEC和杯状细胞中进行sgRNA评估，并与三重报告基因阴性细胞群进行比较。

#3

研究结果

Results

1. 人类SI类器官全基因组CRISPR敲除筛选

经过优化的人小肠（SI）类器官表现出所有主要细胞系的自发生成，而无需转录因子的过度表达。研究人员使用CRISPR筛选平台来发现控制成人LGR5+肠道干细胞细胞谱系承诺的转录因子，并对类器官进行了慢病毒介导的文库整合。研究发现，CHGA+ EEC和MUC2+细胞的命运分离发生在分泌性祖细胞早期，而DEFA5+ Paneth细胞在MUC2+祖细胞中出现较晚，说明ISC的命运决定是有顺序的。接着研究使用了sgRNA来评估必需基因和细胞适应度基因在分化过程中的作用，并发现一些基因对EEC和杯状细胞的分化至关重要。其中GFI1通过抑制NEUROG3驱动的EEC细胞对杯状细胞分化至关重要（图1A-C）。

2. ZNF800抑制EEC分化

研究发现ZNF800-/-类器官含有更多的EEC，而杯状细胞和Paneth细胞的数量则大大减少。进一步的单细胞RNA测序表明，ZNF800不影响类器官的ISC稳态。此外，早期EEC和EC在ZNF800−/−类器官中增加，而其他EEC亚型则减少。在ZNF800−/−类器官中重新引入WT ZNF800蛋白，成功挽救了杯状细胞和潘氏细胞的分化，并抑制了EEC细胞系定型（图1B-F、2）。

图1

图2

3. ZNF800抑制内分泌TF调控网络

研究人员利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)和染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)等技术手段，研究了ZNF800基因在肠道细胞分化中的调控作用。结果显示，ZNF800−/−类器官中EEC特异性转录因子的调节活性明显增加。进一步的分析发现，ZNF800具有转录抑制作用。此外，基因富集分析表明，ZNF800主要结合在神经和内分泌腺体发育通路相关基因上。研究人员进一步生成了成了 NEUROD1-/-类器官，发现NEUROD1 是一种晚期 TF 调节因子，不会影响 EEC 或杯状二元细胞。实验还表明，ZNF800可以单独触发EEC细胞和杯状细胞之间的动态可逆平衡（图3）。

图3

4. GFI1和ZNF800分别独立抑制EEC分化

通过双敲除(GFI1−/−;ZNF800−/−)实验发现，单敲除两者独立发挥作用且互不影响，而双敲除导致杯状细胞和Paneth细胞进一步消失。总的来说，ZNF800和GFI1作为EEC分化的抑制因子独立发挥作用。

5. PAX4直接驱动ZNF800下游的EC分化

在研究中发现，敲除ZNF800后多种细胞类型的一组基因会上调，包括COL4A2、TMEM178B和BTBD11，但这些基因的表达模式和功能与EEC表型没有直接关系。研究人员重点研究了ZNF800的三个直接靶基因INSM1、SOX4和PAX4，发现敲除INSM1可完全逆转EEC诱导，敲除SOX4或PAX4可减少EEC数量。进一步分析CHGA+细胞群体中的EEC亚型，发现敲除INSM1或SOX4可引起CHGA+细胞中EC细胞(TPH1)的轻度减少，PAX4的缺失导致EC偏向的EEC向其他亚型转换，这表明PAX4对失去ZNF800后出现的EC偏态EEC分化轨迹有一定的影响。ARX在ZNF800−/−条件下表达下调，在PAX4−/−单敲除和ZNF800−/−;PAX4−/−双敲除条件下表达上调。在小鼠胰腺发育过程中，Pax4和Arx之间存在相互的转录抑制。在人类SI类器官中使用FLAG标记的ARX进行了ChIP-qPCR，发现ARX不与PAX4上游增强子区结合。整体结果表明，PAX4单向抑制ARX，并且抑制作用不涉及先前描述的调控元件进行的直接染色质相互作用（图4）。

图4

小结

本文研究发现ZNF800作为肠内分泌细胞分化的主要抑制因子，通过抑制PAX4的表达来调节肠内分泌细胞的分化，特别是限制肠内色素细胞的分化。这一发现为我们深入了解肠内分泌细胞的分化提供了新的视角，帮助我们更深入的了解肠内分泌细胞分化的机制。此外，研究还展示了CRISPR筛选技术在研究细胞分化和发育中的应用前景，为治疗代谢性疾病提供了新的治疗思路。

参考文献

Lin L, DeMartino J, Wang D, van Son GJF, van der Linden R, Begthel H, Korving J, Andersson-Rolf A, van den Brink S, Lopez-Iglesias C, van de Wetering WJ, Balwierz A, Margaritis T, van de Wetering M, Peters PJ, Drost J, van Es JH, Clevers H. Unbiased transcription factor CRISPR screen identifies ZNF800 as master repressor of enteroendocrine differentiation. Science. 2023 Oct 27;382(6669):451-458. doi: 10.1126/science.adi2246. Epub 2023 Oct 26. PMID: 37883554.

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