人乳寡糖（HMOs）是成熟母乳中含量第三丰富的固体成分，仅次于乳糖和脂质，由于其对人类健康的积极影响以及在高质量婴儿奶粉配方中的广泛应用而受到诸多关注。结构上，HMOs 可分为岩藻糖基化中性 HMOs、非岩藻糖基化中性 HMOs 和唾液酸化酸性 HMOs 三种类型。其中，唾液酸化的 HMOs 约占 12-14%，而 3′-唾液酸乳糖（3′-SL）作为最具代表性和结构最简单的类型，尤为引人注目。
3′-SL 由 N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和乳糖单元组成，是一种具有多种重要生理功能的生物活性分子。它不仅能够刺激肠道中有益细菌的生长，而且在抗炎、抗病毒和抗菌方面也表现出显著的功效。此外，3′-SL 还可用于预防坏死性小肠结肠炎、增强免疫功能和促进婴儿大脑发育。
传统的提取方法和化学合成途径在制备 3′-SL 时效率低下，且对环境污染严重。因此，寻求可持续的生物合成技术已成为研究焦点。然而，当前的生物合成方法和产量仍无法满足工业生产的需求。因此，寻找合适的菌株以实现低成本、高效生产 3′-SL 已成为当前迫切需要解决的问题。
近日，来自江南大学的研究团队提出了一种创新且高效的 3′-SL 生产方法。他们运用基因编辑技术，精准地将能催化 3′-SL 合成过程中酶促反应的基因整合到大肠杆菌的基因组中。在此基础上，通过优化代谢网络的方法，调整其内部代谢通路平衡，从而促进 3′-SL 的合成，最终成功地构建出能够高效合成 3′-SL 的大肠杆菌菌株。
基于这一策略，最终得到的工程菌株在摇瓶中产生了 9.04 g/L 的 3′-SL，而在 3 L 的生物反应器中进行补料分批发酵时，产生了 44.2 g/L 的 3′-SL，是迄今为止报道的最高产量。
这项研究成果已经以“Metabolic Engineering of Escherichia coli for High-Titer Biosynthesis of 3′-Sialyllactose”为题发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上。该论文的通讯作者是江南大学食品学院教授张涛，她主要从事食品加工及功能性食品配料加工方面的研究。
（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）在生物技术和生物工程领域，大肠杆菌因其易于培养、遗传背景清晰等特性而被广泛用作底盘细胞，然而，大肠杆菌没有 3′-SL 的内源性合成途径。为实现这一目标，研究团队经过分析，首先确定了生产 3′-SL 所需的关键组件：CMP-Neu5Ac 和 α2,3-唾液酸转移酶（α2,3-SiaT）。CMP-Neu5Ac 是 3′-SL 合成的前体物质，而 α2,3-SiaT 则是催化 CMP-Neu5Ac 与乳糖结合生成 3′-SL 的关键酶。
▲图 | 大肠杆菌中 3′-SL 生物合成途径的示意图（来源：上述论文）
为了找到高效的 α2,3-SiaT 酶，研究团队进行了广泛的筛选工作。他们从多种生物样本中提取了 α2,3-SiaT 酶的基因，并在大肠杆菌中进行了表达测试。通过比较不同来源的酶在催化效率、稳定性和底物特异性等方面的表现，筛选出了性能最佳的 α2,3-SiaT 酶，该菌株（BZ03）的 3′-SL 产量达到了 2.27 g/L。
随后，研究团队通过模块化工程的方法优化代谢网络，通过精确调控 CMP-Neu5Ac 合成途径中的关键酶基因来实现产量最大化，验证了优化 3′-SL 从头合成途径中相关基因的组合表达可以提高其产量。
为确保大肠杆菌能够优先合成 CMP-Neu5Ac 并高效表达 α2,3-SiaT，研究团队对代谢网络进行了更进一步地精细调控和优化。
研究团队发现，增加细胞内 UDP-GlcNAc（一种 ManNAc 和 Neu5Ac 的前体物质）的合成有助于提高 3′-SL 的产量。而 UDP-GlcNAc 的积累需要三种酶的顺序催化，这些酶分别由 glmS、glmM 和 glmU 基因编码。当三个基因 glmSMU 同时过表达时，能够显著促进该菌株（BZ30）3′-SL 的生物合成，其产量达到了 3.94 g/L。
另外，由于认识到果糖-6-磷酸（Fru-6-P）和葡糖胺-6-磷酸（GlcN-6-P）是 3′-SL 生物合成中的关键前体物质。研究团队通过构建谷氨酰胺循环系统实现了 L-谷氨酰胺和 Fru-6-P 到 L-谷氨酸和 GlcN-6-P 的循环利用。这个循环由 glmS 和 glnA 基因编码的酶催化完成，在引入该基因后，菌株（BZ31）的 3′-SL 产量达到了 4.27 g/L，这一数据表明谷氨酰胺循环系统的表达加速了 3′-SL 的积累。
在此基础上，研究团队还想通过阻止竞争途径的代谢流量来进一步提高 3′-SL 的产量。他们先后删除了 nanA 基因（会阻碍前体 CMP-Neu5Ac 的生物合成和积累）、pfkA 基因（导致 Fru-6-P 的分流）、nagB 基因（参与前体 GlcN-6-P 转化为 Fru-6-P 的过程）、nanK 基因（促进 ManNAc 向 ManNAc-6-P 的代谢）和 manA 基因（导致 Fru-6-P 到 Man-6-P 的分流），依次得到菌株 BZA1、BZAP1、BZAPB1 和 BZAPK1，其 3′-SL 产量分别达到 4.46 g/L、5.69 g/L、5.91 g/L、6.25 g/L 和 6.98 g/L。
再后来，研究团队探究了如何通过调整核糖体结合位点（RBS）和蛋白质标签来优化 α2,3-SiaT 在大肠杆菌中的表达，进而提高 3′-SL 的产量。在这一过程中，首先指出 α2,3-SiaT 溶解能力和催化活性较弱是限制 3′-SL 产量的因素。随后通过多级组合策略，调整 RBS 和添加蛋白质标签，进而影响基因的转录和翻译效率。研究者筛选了七种不同的 RBS 序列，并分别替换到目标基因 pm0188 的原始 RBS 上，然后将这些 RBS 插入到大肠杆菌中，观察对 3′-SL 产量的影响。结果发现，含有 RBS（BBa_J01080）的菌株 BZAPKA9 产量最高，达到 8.39 g/L，比对照组提高了 36.6%。
接下来，研究团队进一步考虑了通过添加蛋白质标签来提高 α2,3-SiaT 的溶解性。他们将六种不同的蛋白质标签（MBP、DsbA、trxA、SUMO、InfB 和 pelB）融合到 Pm0188*的 N 端，构建了新的菌株。结果发现，含有 InfB 标签的菌株 BZAPKA14 产量最高，达到 9.04 g/L，比对照组提高了 7.7%。这说明 InfB 标签有助于提高 α2,3-SiaT 的溶解性和活性。
最后，研究团队使用 BZAPKA14 菌株，在 3 L 生物反应器中进行发酵生产 3′-SL。他们通过向初始培养基中间歇性的添加乳糖和甘油，以及采用 pH 反馈策略来补充甘油，成功地提高了 3′-SL 的产量。在发酵 83 小时后，3′-SL 的最大产量达到了 44.2 g/L，这是摇瓶培养的五倍之多，是迄今为止报道的最高数据。
▲图 | 通过 3 L 生物反应器使用 BZAPKA14 菌株进行了补料分批发酵 3’-SL 的生物合成培养（来源：上述论文）
综上所述，这项工作标志着生物合成高效生产 3′-唾液酸乳糖方面取得的巨大进步，也为生物合成其他高价值化合物的平台菌株的构建贡献了可借鉴的经验。
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