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MicroRNA（miRNA）是一类在真核生物中广泛存在的约22个核苷酸长度的内源单链非编码RNA分子。自2002年首次发现植物miRNA以来，miRNA迅速成为植物分子生物学领域的研究热点。数十年的研究表明，miRNA在植物生长发育、信号转导、环境胁迫响应和次生代谢产物形成等方面发挥着重要的调控作用，因此开展miRNA的相关研究具有非常重要的意义。正所谓“工欲善其事，必先利其器”，本期伯小远就带着大家一起盘点一下miRNA的研究方法，希望对大家的科研有所帮助！
1.miRNA的背景介绍
在正式学习有关miRNA的研究方法之前，小远想和大家一起回顾一下有关miRNA的背景知识。
1.1 miRNA的生物发生过程
植物miRNA的生物发生过程主要包括miRNA的转录、miRNA前体的剪切、miRNA的甲基化和miRNA诱导沉默复合体（RISC）的形成等几个主要过程。首先，细胞核中编码miRNA的基因在RNA聚合酶II的作用下转录形成长度约为几百个核苷酸的初级转录物，随后在其5'端进行加帽，并在其3'端进行聚腺苷酸化，并折叠形成初级miRNA（primary miRNA, pri-miRNA），然后在DCL、HYL1和SE等核心组分组成的剪切复合体的作用下形成miRNA的前体（precursor mRNA, pre-miRNA），pre-miRNA会被继续剪切形成双链miRNA。接着在miRNA甲基转移酶HEN1的作用下，双链miRNA的3'末端发生甲基化修饰，从而抑制miRNA的降解。最后，双链成熟miRNA的一条链会加载到RISC中，而另一条链则会被降解（图1）。
图1 植物miRNA生物发生的主要过程(Deng et al., 2022)。
1.2 miRNA的调控模式
在植物中，miRNA主要通过剪切mRNA和抑制翻译两种方式对靶基因进行负调控（图2）。其中，miRNA对mRNA的剪切主要通过ARGONAUTE（AGO）蛋白的核酸内切酶活性来发挥作用。成熟的miRNA可以与AGO蛋白组装成RISC复合体，miRNA通过识别与自身核苷酸互补配对的靶基因mRNA并与之结合后，AGO1可以特异性地在miRNA第10~11位对应的靶基因mRNA的位置切断核苷酸之间的磷酸二酯键，产生两段切割产物，随后mRNA 5'和3'端片段会进入核酸外切酶降解途径。需要注意的是，有些被miRNA剪切的mRNA片段除了进入核酸外切酶降解途径以外，还有可能产生具有一定相位的siRNA（phased siRNAs, phasiRNA）。
由于植物蛋白抗体开发不足，限制了对miRNA靶基因蛋白水平的检测，加之miRNA对靶基因mRNA剪切的研究被大量报道，在很长一段时间内，研究人员都认为植物miRNA主要通过剪切靶基因mRNA发挥作用。随着越来越多的研究表明有的植物miRNA并不影响靶基因mRNA的水平，而是降低靶基因蛋白的水平，由此提出植物miRNA也存在与动物miRNA类似的抑制蛋白翻译的作用。其大致机制是，成熟的miRNA与AGO1等相关功能蛋白结合后形成复合体，借助内质网上的ALTERED MERISTEM PROGRAM 1（AMP1）等蛋白定位到正在翻译的靶基因mRNA上，阻止核糖体的组装及翻译，不过该机制还需要更加深入的研究（张翠桔等，2020）。
图2 植物miRNA作用模式概述(Yu et al., 2017)。
1.3 有关miRNA的其他知识点
对于初次接触miRNA的小伙伴来说，在阅读文献时肯定被miRNA的名字困扰到吧，大家一定很奇怪为啥文中出现了几种不同的写法？小远第一次看文献的时候也是一头雾水，所以专门去查了miRNA的命名规则来和大家一起分享。下图是miRBase的miRNA命名规则（图3），目前miRNA的命名基本遵循这个规则，当然在命名规则确定之前发现的miRNA还保持原来的名字。
图3 miRNA的命名规则（图片来源：伯远生物科研绘图团队）。
除了被miRNA的命名搞得一头雾水外，大家是不是也曾分不清siRNA、shRNA和miRNA，尤其是siRNA和miRNA，因为它们有许多相同之处，对于刚接触miRNA研究的小伙伴来说，很容易把它们混为一谈，关于这三种RNA的详细介绍，大家可以查阅小远的往期文章“siRNA、shRNA和miRNA，还在傻傻分不清？”进行学习哦。
2. miRNA的基本研究思路
在开展miRNA的相关研究前，首先是要确定待研究的miRNA，大家一般可以结合已有的生物学现象，对实验组/对照组进行miRNA-seq寻找差异的miRNA，或者通过查阅文献资料以及数据库信息来确定待研究的miRNA。确定好要研究的miRNA后可以通过构建过表达载体/沉默载体，结合稳定转化/瞬时转化实验来验证miRNA的生物学功能。另外，还可以通过生物信息学预测结合降解组测序、5' RLM-RACE、荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹等实验确定miRNA的靶基因，并综合解析miRNA-靶基因-表型三者之间的调控关系。
3. miRNA研究的相关技术方法
3.1 miRNA-seq
miRNA-seq是为了检测miRNA的表达情况发展起来的高通量测序方法。由于miRNA的序列很短，因此建库时可以直接添加接头，进行逆转录扩增，通过PCR扩增并添加测序接头，然后纯化特定范围的DNA片段，进行上机测序，结合数据分析可以了解miRNA的表达情况（图4）。
图4 miRNA测序实验流程图。
2023年6月，Wang等人在Frontiers in Plant Science杂志上发表了一篇题为“Integrated transcriptome and microRNA sequencing analyses reveal gene responses in poplar leaves infected by the novel pathogen bean common mosaic virus (BCMV)”的研究论文，报道了菜豆花叶病毒（BCMV）对杨树的影响以及杨树响应病毒感染的分子机制。在该论文中，作者利用RNA-seq和miRNA-seq分析揭示了杨树患病叶片中差异表达的基因以及miRNA。其中，miRNA-seq数据分析显示在短期病叶（SD，有新出现的轻微花叶症状）中共鉴定到84个差异表达的miRNA，在长期病叶（LD，具有典型且显著的花叶症状）中共鉴定到89个差异表达的miRNA。这些差异表达的miRNA中有78个是已知的，它们属于21个miRNA家族，其中miR156是最大的家族，有12个成员，其次是miR395和miR167等。结果还显示，属于同一家族的miRNA在SD和LD叶片中具有相同的表达模式。随后，作者利用TargetFinder进一步预测了这些miRNA的靶基因，在SD叶片中共预测到2079个目标基因，而在LD叶片中预测了1656个目标基因。预测基因的KEGG分析表明，SD叶片中没有代谢途径显著富集，而LD叶片中显著富集的代谢途径是过氧化物酶体通路和异喹啉生物碱的生物合成通路（图5）。
图5 杨叶染病叶片中差异表达基因（DEGs）和差异表达miRNA（DEMs）的维恩图和KEGG信号通路富集分析图(Wang et al., 2023)。（A）杨树染病叶片中DEGs的维恩图；（B、C）SD叶片和LD叶片中DEGs的KEGG信号通路富集分析图；（D）杨树染病叶片中DMEs的维恩图；（E、F）SD叶片和LD叶片中DMEs的KEGG信号通路富集分析图。
3.2 miRNA的过表达
对目的miRNA进行过表达研究，首先需要找到目的miRNA的前体序列（pre-miRNA），再构建强启动子驱动pre-miRNA表达的过表达载体（图6），然后根据自己的实验目的进行稳定转化或瞬时转化，从而研究miRNA的生物学功能。
在此推荐几个寻找miRNA前体序列的网站：
（1）miRBase：
http://microrna.sanger.ac.uk；
（2）PmiRKB：
PmiRKB Homepage (zju.edu.cn)；
（3）RNAcentral：
https://rnacentral.org/search?q=sbi-MIR156d。
图6 miRNA过表达载体构建示意图（图片来源：伯远生物科研绘图团队）。
3.3 miRNA的沉默
除了对miRNA进行过表达外，沉默miRNA也是解析其生物学功能的常用方法，在本次推文中小远主要介绍两种沉默miRNA的方法，它们分别是短串联靶标模拟（Short tandem target mimic，STTM）技术和CRISPR/Cas9技术。
3.3.1 STTM
STTM可以在植物体内特异地诱导miRNA的降解，从而降低内源miRNA的水平。该技术的原理是人工合成一段短串联靶标模拟物，中间有一段48nt左右的特定核苷酸序列，两端分别含有目标miRNA结合位点，每段miRNA结合序列包括3个非互补碱基（CTA），该序列能与目标miRNA结合形成非完全互补双链，从而有效地阻止miRNA与靶基因mRNA的结合（图7）。
图7 STTM166-48的载体设计策略（图片来源：伯远生物科研绘图团队）。
3.3.2 CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9技术也可以被用于部分miRNA的基因编辑及功能解析。利用该技术对MIR基因序列进行编辑时，sgRNA一般设计在成熟miRNA或前体茎环结构所在的位置，从而实现敲除miRNA的目的，但是由于受到PAM序列的限制，在实际研究中不一定存在合适的sgRNA(Deng et al., 2022)。
2020年7月，Bi等人在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Disruption of miRNA sequences by TALENs and CRISPR/Cas9 induces varied lengths of miRNA production”的研究论文。在该论文中作者利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥的MIR160a进行了基因编辑，通过在miR160a和miR160a*链上分别设计gRNA，并构建含有这两个gRNA的载体，结合遗传转化最终成功获得了大片段缺失的突变体（图8）。
图8 使用CRIPSR/Cas9对拟南芥MIR160a进行基因编辑(Bi et al., 2020)。（a）含有双gRNA的CRISPR/Cas9的设计。miR160和miR160a*链以粗体和下划线表示。PAM和双链断裂 （DSB）位点均已标记。gRNA和基因组DNA之间的配对序列用蓝色和橙色标记。产生的47或48bp片段删除如下所示。（b）两周龄的野生型和mir160a‑△47植株。（c）mir160a‑△47突变体花的表型。（d）野生型和mir160a‑△47突变体相同发育阶段的果荚表型。（e）野生型和mir160a‑△47突变体的种子，蓝色箭头表示发育延迟或中止的种子，白色箭头表示未受精的胚珠。
3.4 miRNA的检测
对miRNA进行过表达/沉默后，需要通过检测miRNA的水平来判断实验是否成功。由于miRNA不能翻译成蛋白，所以就只能在转录水平上进行检测。目前用于检测miRNA表达的方法包括定量PCR、Northern blot、微阵列和RNA测序等，其中比较常用的方法是定量PCR和Northern blot。需要注意的是，由于成熟miRNA序列较短，用定量PCR检测时，需要通过茎环法或加尾法延长成熟miRNA的序列才能进行定量。有关miRNA检测方法的详细描述以及miRNA过表达、沉默、检测的文献案例，大家均可以在小远的往期文章“没有什么不同——非编码RNA的研究方法（一）”中进行查阅哦！
3.5 miRNA靶基因的预测与验证
3.5.1 生物信息学预测
通过生物信息学的方法预测miRNA的靶基因可以为后续的功能研究提供重要的线索。由于植物miRNA与靶基因mRNA几乎是以完全互补配对的方式结合，预测时无需复杂的算法，因此植物miRNA的靶基因预测相对比较容易一些。以下是一些常用的预测网站，具体的用法大家可以查询这些网站的操作说明进行学习。
（1）psRNATarget：
http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/
（2）TAPIR：
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/tapir/
（3）miRdeepFinder：
http://www.leonxie.com/DeepFinder.php
（4）psRobot：
http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/index.php
（5）WMD3：
http://wmd3.wei gelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi
需要注意的是通过生物信息学预测的靶基因存在一定的假阳性，miRNA是否可以靶向剪切或抑制靶基因的表达最终仍需要采用生物学实验进行验证哦。
3.5.2 降解组测序技术
降解组测序，又称为大规模平行末端分析，是利用高通量测序技术对被剪切的mRNA片段进行测序分析，准确高效地筛选miRNA靶基因的方法(German et al., 2008)。其工作原理是基于miRNA与靶基因mRNA互补配对后，会在互补位点的第10或11位核苷酸上发生剪切作用产生2个片段。其中，5'剪切片段包含5'帽子结构和3'羟基；3'剪切片段则包含自由的5'单磷酸和3' polyA尾巴。利用只与5'单磷酸RNA连接的特殊接头5' adapter捕获miRNA的剪切产物。随后将捕获到的3'剪切片段反转录成cDNA并扩增，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，将得到的酶切片段与3'双链DNA adapter连接并进行扩增纯化后，可以建立文库用于后续的高通量测序（图9）。通过对测序数据进行分析，能够直观的发现mRNA的某个位点会出现一个波峰，该处正是候选的miRNA剪切位点(董淼等，2013)。
利用降解组测序，大家可以通过实验来寻找miRNA的靶基因，使得数据的准确性和说服力大幅提高，因而该技术也成为了miRNA靶基因鉴定的一大利器，不过该技术不能检测通过影响翻译抑制靶基因表达的miRNA。
图9 降解组测序文库的构建(董淼等，2013)。
2022年6月，Liu等人在Plant Physiology杂志上发表了一篇题为“Maize miR167-ARF3/30-polyamine oxidase 1 module-regulated H2O2 production confers resistance to maize chlorotic mottle virus”的研究论文，揭示了Zma-miR167-ZmARF3/30模块通过调节ZmPAO1的表达来抑制玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）感染。在该论文中，作者为了寻找Zma-miR167的靶标，首先使用WMD3和TargetMiRna这两个在线工具进行了初步的预测，结果表明ZmARF3、ZmARF9、ZmARF16、ZmARF18、ZmARF22、ZmARF30和ZmARF34均含有Zma-miR167的结合位点，在进行生物信息学预测时作者之所以重点关注ZmARF，是因为先前的研究报道表明miR167可以靶向ARF基因从而调节各种生物过程(Varaud et al., 2011; Kinoshita et al., 2012; Barik et al., 2015; Wang et al., 2015; Na et al., 2019; Song et al., 2019; Yao et al., 2019)。随后，作者对从Zma-miR167过表达株系（OE2）和干扰株系（CMV-STTM167）中提取的总RNA进行降解组测序，结果显示ZmARF3和ZmARF30各有一个峰值，表明Zma-miR167在其上有一个剪切位点。而其他被预测为Zma-miR167靶标的ZmARF基因并未检测到明显的剪接峰。另外，作者还通过5'-RNA连接酶介导的cDNA末端扩增实验（RLM-RACE）进一步证实ZmARF3和ZmARF30可以被Zma-miR167直接靶向（图10）。
图10 ZmARF3和ZmARF30会被Zma-miR167剪切(Liu et al., 2022)。（A）降解组测序显示Zma-miR167靶标上有剪切位点，红色箭头表示该位点的降解峰；（B）检测到具有Zma-miR167剪切位点的ZmARF3和ZmARF30的降解产物。黑色箭头表示降解位点。核苷酸峰图对应扩增片段。
3.5.3 5' RLM-RACE
5' RLM-RACE常被用于检测植物miRNA的剪切位点，其检测原理与降解组测序相似，是利用T4 RNA连接酶在mRNA的3'剪切片段的5'端连上一个人工合成的RNA接头，由于完整mRNA的5'端有帽子结构因此不能与RNA接头相连。然后用随机引物进行反转录，接着用接头上的内外两层锚定引物和基因下游的两个特异性引物进行巢式PCR，最后将扩增产物连接到克隆载体上进行测序，将测得的片段与靶基因序列比对即可确定miRNA是否剪切靶基因mRNA及剪切位点(郑小宇等，2021)。
2023年3月，Pei等人在Horticultural Plant Journal杂志上发表了一篇题为“Identification, characterization, and verification of miR399 target gene in grape”的研究论文，阐明了葡萄miR399家族的进化特征并验证了其对靶基因mRNA的切割效果。在该论文中，作者为了寻找葡萄miR399的靶基因，首先利用psRNATarget进行靶基因预测，结果表明miR399家族的成员均可靶向VIT_13s0067g03280（inorganic phosphate transporter 1-3）。此外，VIT_12s0035g00200（phospholipase D delta-like）、VIT_12s0059g02000（beta-glucuronosyltransferase GlcAT14A）等也是大多数miR399成员的靶标。基于先前的研究报道，在“Kyoho”和“Fengzao”葡萄转录组的整体比较中，只有vvi-miR399b存在差异表达(Guo et al., 2018)。因此，作者选择vvi-miR399b来验证其对靶基因mRNA的剪切作用，首先利用双荧光素酶报告基因检测系统检测发现vvi-miR399b可以作用于inorganic phosphate transporter 1-3、phospholipase D delta-like以及beta-glucuronosyltransferase的靶位点，并对靶基因有调节作用（图11 A、B）。接着，作者利用5′ RLM-RACE实验做了进一步的验证，结果显示vvi-miR399b对靶基因的剪切主要发生在vvi-miR399b与靶基因mRNA互补区域的第10或第11位核苷酸上（图11 C）。
图11 验证葡萄miR399对其靶基因的剪切效果(Pei et al., 2023)。（A）双荧光素酶载体示意图；（B）Luc/Ren比值（WT表示vvi-miR399b靶序列；MUT表示突变的vvi-miR399b靶序列）；（C）用于验证靶基因预测的5′ RLM-RACE实验结果。
3.5.4 RT-qPCR与蛋白免疫印迹
miRNA负调控靶基因的结果是靶基因mRNA水平和蛋白水平下降（或仅蛋白水平下降）。因此，可以利用RT-qPCR和蛋白质免疫印迹进一步验证通过生物信息学等手段发现的靶基因。通过检测过表达或抑制miRNA表达前后植物体内靶基因的mRNA和其编码蛋白表达量的变化，可以确定miRNA与靶基因的调控关系。不过，由于植物中高质量的抗体制备比较困难，所以蛋白免疫印迹的应用会相对较少一些。
因为没有检索到比较合适的文章，小远在此只列举一个利用RT-qPCR验证miRNA靶基因的案例，大家如果对蛋白免疫印迹比较感兴趣的话，可以自行查阅文献，也欢迎大家把文献分享给小远！
2023年8月，Xu等人在New Phytologist杂志上发表了一篇题为“Intronic microRNA-directed regulation of mitochondrial reactive oxygen species enhances plant stress tolerance in Arabidopsis”的研究论文，报道了在镉（Cd）胁迫条件下，pre-miR400发生内含子保留，导致miR400的水平下降，其下游靶基因PPR1的表达上调，ROS（活性氧）积累减少，引起轻微的氧化损伤。在该论文中，作者首先利用生物信息学找到了两个miR400的靶基因PPR1和PPR2，为了进一步探究miR400的调控网络，作者在miR400过表达株系（OxmiR400）和miR400干扰株系（STTM400）中检测了PPR1和PPR2的相对表达水平（图12），结果显示在OxmiR400中PPR1和PPR2的表达水平下降，而在STTM400中的表达水平上升，说明miR400可以靶向PPR1和PPR2。
图12 通过RT-qPCR测定的WT、OXmiR400和STTM400植物中PPR1（a）和PPR2（b）的相对表达水平。
文章至此就告一段落了！在本期的推文中小远主要是和大家一起回顾了miRNA的基础知识，并总结了miRNA的一般研究思路和相关的技术方法，希望本次推文对刚接触miRNA以及正在做相关研究的小伙伴们都有一定的启发，当然，文中总结不到位的地方也欢迎大家和小远沟通交流哦！
