这篇文章2020年10月发表于Nature Cell Biology（IF=21.3，SIRT1 is downregulated by autophagy in senescence and ageing，至今总引用为163次），是一篇寻找衰老调控蛋白SIRT1上游的文章，其关于基因表达调控机制，尤其是蛋白的翻译后调控机制的研究思路非常具有代表性，正在做或者准备做相关方向的同学可以借鉴一下。
研究意义：Sirtuins家族是一类高度保守的酶类，具有依赖NAD+的去乙酰化酶以及ADP-核糖基转移酶活性。SIRT1作为其研究较多的家族成员，对细胞代谢和衰老等病理生理过程具有重要的调控作用。哺乳动物SIRT1可以通过去除组蛋白（H3K16）和非组蛋白（p53）的乙酰化发挥功能，表明其作用底物的多样性。作者之前的研究发现，酵母Sir2（SIRT1的同源基因）表达随着复制型衰老的进展而减少，表明其调控衰老，但哺乳动物SIRT1在衰老过程中表达的改变未知【1】。细胞衰老是一种端粒缩短/胞外刺激引起的细胞周期持续性停滞，其在组织里含量的增加是组织衰老的主要特点。抑制/去除衰老细胞能缓解衰老相关疾病，具有重要的病理/生理意义。
研究策略：这篇文章主要是作者把前期酵母的研究结果延伸到哺乳动物，从而提出“SIRT1在衰老过程中的动态变化及其调控机制”这一科学问题。立足于实验室前期扎实的研究基础，作者利用成熟的细胞模型揭示了其动态变化，并在确定该变化发生的层级后进一步探讨了其调控机制，然后用动物模型和人体样本验证了该机制。
1、 SIRT1 protein is reduced during cellular senescence.
为阐明SIRT1在哺乳动物细胞衰老过程中表达水平的改变及其机制，作者首先检测了复制型衰老模型、癌基因和DNA损伤药物等应激诱导的衰老模型、原代皮肤成纤维细胞衰老模型SIRT1的表达改变。衰老细胞SIRT1蛋白表达显著减少，而因接触抑制而保持稳态的细胞SIRT1无显著改变（图1A-E）。那么SIRT1表达随着细胞衰老进展减少是从哪个层面开始的呢（RNA or蛋白）？于是作者检测了SIRT1 mRNA改变。癌基因和DNA损伤药物处理形成的衰老细胞SIRT1 mRNA不变；复制衰老细胞mRNA降低，但其降低幅度不如蛋白（图1F-H）。因此，哺乳动物衰老细胞SIRT1蛋白表达减少，其机制与mRNA表达或稳定性无关（SIRT1蛋白减少是蛋白层面的减少）。
2、 SIRT1 is subjected to autophagosome–lysosome degradation during cellular senescence.
由于蛋白酶体降解和溶酶体降解是介导正常细胞蛋白降解的主要途径，所以作者检测了二者对SIRT1蛋白表达的影响。蛋白酶体抑制剂MG132处理对衰老细胞SIRT1无显著影响，自噬溶酶体抑制剂Lys05显著恢复SIRT1表达（图2A-B）。所以，细胞衰老过程中SIRT1通过溶酶体途径降解。溶酶体介导的自噬增加是细胞衰老的重要特征，作者最近的研究发现，自噬可以降解核蛋白lamin B1【2】。因此，作者推测衰老相关自噬也可以促进SIRT1降解。敲低自噬蛋白Atg7诱导衰老发现，衰老细胞SIRT1表达降低的现象得到了缓解（图2C）。敲除衰老细胞的Atg7则显著缓解SIRT1下调，但不影响细胞周期（图2D）。接下来，作者检测了SIRT1在衰老细胞的定位（是否定位于溶酶体）。增殖细胞SIRT1主要位于细胞核，而衰老细胞SIRT1部分定位于细胞质，且与自噬蛋白LC3共定位（图2E）。此外，作者用双荧光蛋白标记的SIRT1探究了其细胞定位（GFP在低pH的溶酶体内弱发光，即位于溶酶体的SIRT1呈红色，溶酶体外的SIRT1呈黄色）。增殖细胞SIRT1主要定位于细胞核呈黄色，衰老细胞其细胞质内有发红光的SIRT1（图2F）。且用Lys05升高溶酶体pH能促使胞质由红色变为黄色（图2G）。因此，衰老细胞SIRT1通过自噬溶酶体途径降解。
3、 SIRT1 associates with the autophagy protein LC3.
蛋白和自噬蛋白的结合自噬降解至关重要。经过检测发现，SIRT1和LC3特异性结合（图3A）。BiFC结果表明，SIRT1和LC3的确存在相互作用（图3B）。对衰老过程中二者相互作用进行检测发现，衰老细胞SIRT1和LC3相互作用显著增加，但核p62自噬蛋白的相互作用没有显著改变，且衰老细胞细胞核内的SIRT1和LC3结合也显著增加（图3C-D）。相反，存在接触抑制的稳态细胞，其SIRT1和LC3相互作用不受影响（图3E）。接下来作者探讨了二者相互作用增强的机制。由于LC3的底物磷酸化状态影响其与底物的结合，作者用λ蛋白磷酸酶去除细胞磷酸化，结果显示，二者的相互作用显著增强，这与质谱检测结果一致（图3F-G）。所以，衰老细胞SIRT1磷酸化水平降低促进SIRT1与LC3相互作用。由于饥饿细胞的SIRT1使LC3去乙酰化，进而促进自噬。作者检测了衰老细胞里SIRT1对LC3的调控作用。结果显示，敲除衰老细胞SIRT1对LC3II（由自噬时LC3的酶解生成）水平没有影响（图3H）。虽然饥饿处理的细胞LC3大量累积在胞质，但衰老细胞却有大量LC3定位于细胞核（图3I）。此外，用缺乏不同营养物质的培养基处理细胞不影响SIRT1表达，表明饥饿并非通过影响SIRT1表达影响细胞自噬（图3J）。因此，衰老细胞SIRT1磷酸化水平降低增强SIRT1与LC3的结合和其溶酶体降解。
4、 SIRT1 interacts with LC3 through an LIR motif.
接下来作者探究了介导SIRT1和LC3相互作用的氨基酸位点。突变LC3的底物识别（F52A）/脂化过程（对自噬体形成至关重要，G120A）相关氨基酸位点，F52A突变显著影响二者相互作用（图4A）。由于和LC3结合需要LIR模体（W/F/T）XX（L/I/V），且该模体N端若含有酸性氨基酸（E/D）则可以增强该结合作用。具体结合时，（W/F/T）和LC3的一个疏水域结合，（L/I/V）和另一个含有F52残基的疏水域结合，而图4A的结果提示我们：SIRT1通过LIR或与LIR类似的结构结合LC3。通过分析，作者找到了8个SIRT1与LC3互作的潜在模体（图4B）。通过短肽竞争性IP实验，作者发现了三个可以和全长SIRT1竞争结合LC3的短肽（图4C）。为找到最重要的LIR，作者突变全长SIRT1里上述潜在LIR的重要氨基酸位点，发现只有W221A和V224A双突变（WV）的LIR（位于221-224）会显著影响SIRT1和LC3的相互作用（图4D）。更重要的是，WV突变的SIRT1短肽（205-233）不再有和全长SIRT1竞争结合LC3的能力（图4E）。所以，SIRT1的（221-224）LIR对SIRT1-LC3相互作用至关重要。
接下来，作者检测了（221-224）LIR对SIRT1溶酶体降解的影响。由于该模体位于SIRT1的催化结构域附近，作者检测了SIRT1的WV突变对SIRT1去乙酰化酶活性的影响。虽然WV突变可以显著抑制酶活性，但用SIRT1激活剂处理细胞发现酶活性改变不影响SIRT1-LC3的相互作用，以及衰老细胞SIRT1的减少（图4F-H）。因为SIRT1影响细胞衰老，为了避免不同突变体因酶活性差异导致细胞衰老程度不同，从而影响SIRT1-LC3相互作用的比较，作者在HEK293T细胞过表达I347A突变的SIRT1（使SIRT1丧失酶活性）。结果表明，I347A突变细胞SIRT1和LC3仍存在相互作用（图4I）。最后，作者比较了I347A突变和WV+I347A突变细胞SIRT1和LC3相互作用的差异，以及衰老过程中SIRT1降解的差异。WV+I347A突变后SIRT1和LC3相互作用显著减弱，SIRT1降解也得到了显著缓解，同时，细胞核内SIRT1显著升高，胞浆SIRT1显著降低（图4J-K）。因此，SIRT1通过（221-224）LIR和LC3相互作用并促进其溶酶体降解，降低核内SIRT1水平。
5、 SIRT1 undergoes lysosomal degradation during ageing in mice and humans.
接下来作者在体内水平验证自噬调控SIRT1蛋白表达。老年小鼠的脾脏、睾丸和胸腺SIRT1表达显著降低，但其mRNAs表达没有显著改变，心、肝脏、肾脏、胰腺、子宫、肺和肌肉组织的SIRT1蛋白表达没有显著改变（图5A-G）。用Lys05处理小鼠，脾脏和睾丸的SIRT1蛋白表达回升，mRNA仍无显著改变（图5H-K）。所以，衰老小鼠部分组织里的SIRT1通过溶酶体途径降解。同时，老年小鼠造血干细胞（HSPCs）SIRT1蛋白亦显著减少，但mRNA表达无明显改变，且Lys05处理后能恢复其蛋白表达（图5L-M）。值得注意的是，用Lys05处理HSPCs不影响年轻小鼠的SIRT1表达，表明自噬只特异性影响衰老细胞SIRT1蛋白（图5N）。由于小鼠HSPC衰老与SIRT1有关，而CD8+CD28-T细胞积累是免疫系统衰老的标志，CD8+CD28-T细胞SIRT1蛋白表达降低，但mRNA水平不变。所以作者检测了自噬对老年供者CD8+CD28-T细胞SIRT1表达的影响。老年供者SIRT1表达显著减少，而Lys05处理则能够显著恢复其表达（图5O）。因此，自噬可以调控衰老小鼠部分组织和老年供者T细胞SIRT1蛋白表达。
这篇文章相对于正式的research article而言，比较简单，毕竟是一篇letter形式的文章（但其数据量也不小）。作者以“哺乳动物衰老时SIRT1表达的动态改变及其调控机制”为科学问题，进行了中规中矩的探讨。蛋白变化→RNA/蛋白层面的改变→蛋白改变但RNA不变→蛋白稳定性改变→蛋白降解两条主要途径：溶酶体/蛋白酶体→溶酶体调控→自噬蛋白与SIRT1互作检测→互作机制解析→体内/供者标本验证，是常见的做蛋白翻译后修饰的论证逻辑。这里有一个问题：即探讨SIRT1降解方式时，作者并没有抑制蛋白的翻译，所以我们看到的结果应该是抑制了蛋白酶体/溶酶体后，蛋白翻译正常进行而蛋白降解被阻滞的综合改变，所以SIRT1蛋白不降低是意料之中的，但这里是否还存在“衰老细胞SIRT1翻译减慢”这个可能呢？与作者上一篇自噬降解Lamin B一致，作者鉴定出了自噬的第二个细胞核底物，进一步强调了“细胞核自噬”这个概念和其功能【2】。但文章就只研究了这一部分内容，对于衰老过程谁影响了SIRT1磷酸化，影响了SIRT1哪些位点的磷酸化，谁的上游还有谁在调控这条通路，都是没有说明的问题。此外，最后小鼠组织的验证有很大部分的阴性数据，是否表明哺乳动物很多器官的衰老与SIRT1无关（当然，也可能是这些器官组织还没到衰老的阶段）？虽然期刊档次到了，引用量也很不错，但问题也还是存在的，欢迎大家讨论。
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1. Dang, W. et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature 459, 802, doi:10.1038/nature08085 (2009).
2. Dou, Z. et al. Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature 527, 105, doi:10.1038/nature15548 (2015).#优质作者榜#
