这篇文章2020年4月发表在在Cell Reports（IF=8.8，TBK1 and IKKε Act Redundantly to Mediate STINGInduced NF-kB Responses in Myeloid Cells，截至2022年总引用68次），是一篇较简单纯机制探讨的文章。其寻找科学问题的视角，以及简洁的实验验证过程值得借鉴学习。

研究意义：免疫细胞表达的模式识别受体（PRRs）对细胞因子、趋化因子和干扰素的表达至关重要，而响应核酸的PRRs则是机体抗病毒感染的“发起者”。介导IL-1β和IL-18成熟的AIM2蛋白，以及介导抗病毒感染的I型干扰素合成的cGAS是免疫细胞胞浆内识别双链DNA（dsDNA）的主要PRRs。cGAS通过催化ATP和GTP形成第二信使2’3’-cGAMP激活内质网蛋白STING，此外，细菌来源的 3’3’-cGAMP、cyclic-di-AMP和cyclic-di-GMP也可以结合并激活STING^【1】（图0）。值得注意的是，cGAS难以精确识别dsDNA底物，除了识别病毒和细菌来源的dsDNA，它也会识别人体基因组和线粒体来源的dsDNA，其异常识别与帕金森和SAVI等疾病有关。因此，阐明该通路具体机制并对其进行精确调控对自体免疫相关疾病的治疗有重要意义。

cGAS-STING通路主要通过促进IRF3介导的I型干扰素合成以及NF-κB介导的促炎因子（TNF、IL-1β和IL-6等）合成两条通路调控细胞免疫应答。该通路激活使STING二聚体从内质网转移到高尔基体并募集TBK1丝/苏氨酸激酶，TBK1通过磷酸化STING募集并磷酸化转录因子--干扰素调节因子3（IRF3），磷酸化激活的IRF3形成二聚体并入核促进I型干扰素的转录表达。此外，领域认为TBK1也参与STING对NF-κB活性的调控^【1】（图0）。荧光素酶报告基因结果显示，TBK1和其同源蛋白IκB激酶ε（IKKε ，可以抑制IκB活性，从而激活NF-κB信号通路）过表达可激活NF-κB活性，但Tbk^-/-、IKKε^-/-和Tbk^-/-IKKε^-/-小鼠的实验表明，虽然二者对IRF3介导的干扰素生成非常重要，但对TLRs、IL-1β和TNF介导的NF-κB激活没有显著影响。因此，TBK1是否独自参与STING介导的NF-κB激活及其机制需要进一步阐明。

图0

研究策略： 这里作者以“TBK1是否介导STING对NF-κB信号通路激活”为出发点，利用原代敲除细胞株、条件敲除小鼠、永生化敲除细胞株、人原代细胞和人单核细胞系为实验对象，相关通路蛋白激活和因子表达分泌为评价参数进行了系统而简洁的验证，对cGAS/STNG通路两个主要下游IRF3介导的I型干扰素合成和NF-κB介导的炎症因子合成机制进行了全新解析和定义。

研究方法：

1、Primary Macrophages Deficient in TBK1 Exhibit Normal STING-NF-kB Responses & TBK1-Deficient Mice Maintain NF-κB Responses following DMXAA Challenge

由于已知关于TBK1参与STING介导的NF-κB激活的相关结论是在MEF细胞相关实验中得出，所以作者首先用TBK1敲除小鼠原代巨噬细胞进行了验证。结果显示，敲除TBK1显著降低STING通路激动剂刺激巨噬细胞的IFN-β分泌水平，但NF-κB通路因子TNF水平没有显著改变（图1A-C）。作者进一步在体内水平的验证结果显示，TBK1敲除小鼠在STING激动剂刺激下，I型干扰素表达显著降低，但NF-κB通路特异的因子表达水平没有显著改变（图1D）。所以，TBK1的确介导了STING通路调控的I型干扰素合成，但不影响STING通路调控的NF-κB信号通路。

图1

2、TBK1 Is Dispensable for NF-kB Activation Downstream of STING

由于小鼠来源的TBK1敲除巨噬细胞仍残余部分TBK1蛋白，所以作者用CRISPR/Cas9构建了永生化TBK1敲除细胞系。结果显示，敲除STING阻滞了激动剂激活IRF3和p65，但敲除TBK1只抑制IRF3磷酸化激活（图2A）。细胞因子结果显示，虽然敲除TBK1或STING均阻滞IFNβ生成，但敲除STING还能阻滞TNF生成，而敲除TBK1却没有这个效果（图2B）。紧接着，作者用自体激活突变的STING突变慢病毒进行进一步检测。过表达WT型STING对下游活性没有影响，但过表达突变STING显著激活下游通路（图2C）。敲除过表达突变STING细胞的TBK1可以阻滞IRF3的激活，但NF-κB仍能被激活（图2C）。细胞因子结果显示，敲除TBK1阻滞过表达突变STING细胞IFNβ的分泌，但对TNF没有影响（图2D-E）。因此，这里利用自体激活突变体进一步证明，STING激活的NF-κB不一定需要TBK1。

图2

3、TBK1 and IKKε Act Redundantly to Elicit STING-Induced NF-kB Activation

由于TBK1对STING激活的NF-κB通路没有直接的调控作用，所以作者接下来检测了一下其同源家族成员IKKε对该通路的影响。用CRISPR/Cas9敲除TBK1或者IKKε，对STING介导的NF-κB通路激活没有显著影响，但同时敲除TBK1和IKKε则能完全阻滞IRF3和p65在STING激动剂处理下的活化（图3A）。细胞因子结果显示，单敲TBK1或双敲TBK1/ IKKε阻滞IFNβ合成，单敲IKKε对IFNβ合成没有影响，单敲TBK1或者IKKε对TNF合成没有影响，但双敲TBK1/ IKKε则阻滞TNF合成（图3B-C）。

图3

4、STING-Induced NF-kB Responses Are Less Sensitive to TBK1 and IKKε Kinase Inhibition Than Type I IFNs

接下来作者探究了TBK1和IKKε的活性对STING激活后下游信号通路应答的影响。结果显示，抑制TBK1和IKKε活性能显著降低STING激活时的IRF-3活化，但不影响p65活化（图4A）。在TBK1敲除细胞检测IKKε对STING通路激活影响的结果显示，抑制TBK1敲除细胞的IKKε阻滞IRF3的核定位，但不影响p65的核定位（图4B）。细胞因子结果显示，抑制TBK1敲除细胞的IKKε降低IFNβ合成，但不影响TNF的合成（图4C-D）。作者用人的原代细胞和细胞系对上述结果进行了验证。外周血单核细胞实验结果表明，抑制TBK1和IKKε下调IFNB1表达，但对TNF表达没有影响（图4E-F）。THP1细胞过表达突变STING，然后抑制TBK1和IKKε可显著降低IFNB1表达，但不影响TNF表达（图4G-H）。因此，TBK1和IKKε激酶活性对STING活化后I型干扰素的合成非常重要，但对NF-κB通路相关因子的表达则不是特别重要。

图4

5、TAK1 and IKKβ, but Not TRAF6, Are Required for STING-NF-kB Responses

接下来作者尝试找到STING介导NF-κB通路激活的中间分子。TRAF6是TLRs受体激活后介导NF-κB通路激活的主要分子，但作者的检测发现，敲除TRAF6虽然阻滞TLR9配体激活NF-κB信号通路，但不影响STING信号通路介导的NF-κB活化（图5A-B）。作者假定TAK1和IKK复合物是介导STING激活NF-κB通路活化的中间分子。结果显示，抑制IKKβ或TAK1降低STING对p65的磷酸化激活，但对TBK1磷酸化没有显著影响，且抑制TAK1能在一定程度上降低STING、IRF3和TBK1磷酸化（图5C）。综上STING通过TAK1和IKKβ介导NF-κB的活化和应答。

图5

Take-home message：

这篇文章数据量不大，但却凭借在机制上的发现重新定义了cGAS/STING信号通路的信号传递模式，为免疫细胞对病毒/细菌/人体自身DNA作出应答的调控提供了理论基础，也为相关疾病的精确治疗提供了新思路和靶点。文章使用了化学小分子、敲除小鼠模型、敲除细胞模型、过表达持续激活突变体模型（避免使用化学小分子，最大可能排除脱靶效应）对“TBK1是否介导STING调控NF-κB信号通路及其具体机制”这一问题进行了简洁的验证，最后用相关蛋白免疫印迹、qPCR和ELISA实验作为其效应的readout。实验设计和结果评估简洁，得出的结论有非常大的理论和临床价值，这也是其能发表在Cell Reports并收获远高于同期其它文章引用量的原因。所以，如果我们想做有意义的科研，而非“三拼”（工作量、样本量、数据量），就需要对自己研究的领域有深入了解，知道哪里有bug，且修复这些bug对领域有切实重要的意义。如果我们能找到这样的bug，同时还能用简洁明了的实验方法进行验证，这意味着：1、你的科研品位不低；2、这种文章在领域专业杂志上不会吃闭门羹！最后，一个工作是不是好工作，发表以后的论文单篇引用不会说谎。

1. Ma, R. et al. The cGAS-STING pathway: The role of self-DNA sensing in inflammatory lung disease. FASEB J 34, 13156, doi:10.1096/fj.202001607R (2020)