沈阳农业大学吴元华团队揭示了NbMLP28在烟草抗PVY侵染中的作用

英文题目：Identification and functional characterization of NbMLP28, a novel MLP-like protein 28 enhancing Potato virus Y resistance in Nicotiana benthamiana

中文题目：NbMLP28的鉴定和功能分析，一种增强烟草对马铃薯Y型病毒抗性的新型类乳胶蛋白28

期刊名称：BMC Microbiology

影响因子：4.2

作者单位：沈阳农业大学

DOI号：https://doi.org/10.1186/s12866-020-01725-7

前言

主要乳胶蛋白(MLPs)属于betv1蛋白家族的MLP亚家族，对生物和非生物胁迫均有响应，在植物抗病性中起重要作用。马铃薯Y型病毒(Potato virus Y, PVY)是一种分布广泛且具有经济危害性的马铃薯病毒(pottyvirus)的典型种，是世界范围内包括烟草(Nicotiana benthamiana)在内的重要作物的主要病害之一。尽管烟草因PVY感染而损失巨大，但目前尚无研究调查MLPs在产生病毒感染抗性中的潜在作用。

研究路线

研究结果

NbMLP28基因的鉴定及系统发育分析

利用引物扩增烟草NbMLP28的ORF序列，与烟草数据库中NbMLP28的预测ORF序列一致。我们构建了NbMLP28和近缘种MLP家族成员的系统发育树(图1)。结果表明，烟草MLP28与棉花MLP28序列相似性最高，推测为一种防御相关蛋白。多重比对分析结果显示，棉花MLP28与拟南芥MLP28相似性为31.16%，均含有一个序列为GxxxxxG的富含Gly的环(图2a)。通过SWISS-MODEL预测的NbMLP28蛋白结构显示出与棉花和拟南芥MLP28相似的特性(图2b-d)。我们克隆并分析了3000 bp的NbMLP28启动子区域，确定了几个潜在的顺式作用元件，参与Me-JA和光响应，一个参与干旱诱导的MYB结合位点，一个参与生长素响应的元件，一个参与脱落酸(ABA)响应的元件，一个参与缺氧特异性诱导的类增强子元件(表1)。

图1.烟草类乳胶蛋白28与其他植物类乳胶蛋白的系统发育分析

图2.烟草类乳胶蛋白28的序列分析. a.利用DNAMAN分析烟草类乳胶蛋白28与拟南芥MLP28 (NM_105751.5)和棉花MLP28 (ABA01325.1)的序列比对. b-d.烟草类乳胶蛋白28与棉花MLP28和拟南芥类乳胶蛋白28的3d结构

表1.NbMLP28基因启动子的顺式调控元件分析

NbMLP28的亚细胞定位

使用在线Plant-mPLo工具预测了NbMLP28的亚细胞定位。结果表明该蛋白定位于细胞质中。此外，该蛋白含有一个核定位信号肽(GLKGKLVVSMEVKCGGHLFHDLCQTKPHHLL)，得分为4.2分，与NLS Mapper预测的一致。共聚焦结果显示，无论是否感染病毒，NbMLP28主要定位于细胞质膜和细胞核(图3)。

图3.类乳胶蛋白28的亚细胞定位. a.健康烟草中类乳胶蛋白28的亚细胞定位. b.病毒感染时类乳胶蛋白的亚细胞定位

NbMLP28的表达谱

PVY接种后1、3、5、7天，病毒积累量呈上升趋势，7天时达到峰值(图4a)。同样，NbMLP28在PVY-GFP感染1天后被诱导表达，并在2天时达到最大值(图4b)。qRT-PCR分析检测到NbMLP28在健康烟草的各个组织中表达一致，并且根中NbMLP28转录物的水平相对高于其他组织(图4c)。

图4.NbMLP28基因在野生型植物中的表达模式. 接种1.3.5.7天时PVY-GFP表达趋势. b.接种PVY后NbMLP28的表达趋势. c.健康植物根、茎、叶、花中NbMLP28的表达趋势. 数据采用SPSS的邓肯多重极差法进行分析,不同字母表示4个处理的数值有显著差异，P < 0.05

NbMLP28基因的沉默使烟草更容易感染PVY

为了进一步研究NbMLP28在植物防御中的作用，我们使用VIGS对NbMLP28基因进行了沉默。通过比较TRV::MLP28植株与TRV::00对照植株中NbMLP28的表达水平来检测沉默效率。NbMLP28的VIGS效率为87%，TRV::MLP28与对照植株间无表型差异。接下来，我们用PVY-GFP感染TRV::MLP28和对照植株，并监测病毒感染至少1周。结果表明，接种后1-4天，TRV::MLP28组的病毒感染率显著高于TRV::00对照组，接种3天和4天时的病毒感染率分别是对照组的3.6倍和1.2倍(图5)。WB检测到，接种病毒3天后，TRV::MLP28的病毒外壳蛋白水平明显高于TRV::00。TRV::MLP28叶片具有较强的荧光信号，而TRV::00叶片的荧光点较少。特别是，在TRV::MLP28株9天中，GFP信号在整个植株中都检测到，而在TRV::00株仅在叶脉、叶柄和下叶中检测到。TRV::MLP28系统叶片中侵染区数量和大小均显著大于TRV::00(图5c)。此外，与对照组相比，TRV::MLP28植株在9天时表现出严重的新生叶片畸形，这表明在缺乏该蛋白的情况下PVY的严重程度(图5c)。综上所述，这些结果表明NbMLP28的沉默使本拟南麻对PVY感染高度敏感。

图5.沉默NbMLP28对PVY感染的影响. a.沉默NbMLP28 14天后接种PVY，病毒在RNA水平上的表达高于对照TRV::00接种PVY. b.PVY接种3天后，用Western blotting检测病毒蛋白表达差异. 1-2为接种过PVY的TRV::MLP28, 3-4为接种过PVY的TRV::00. c.两种处理的荧光差异

NbMLP28过表达增强PVY抗性

NbMLP28在烟草中短暂过表达，以进一步确定其在PVY感染应答中的作用。用携带35S::MLP28 构建体或35S::00 空载体(阴性对照)的农杆菌侵染拟南芥叶片。通过检测GFP信号强度，比较PVY-GFP感染35S::MLP28和35S::00叶片的病毒积累差异。我们继续观察接种叶片和系统叶片在3天、7天和9天时的病毒荧光差异。接种后3、7和9天，35S::MLP28植株的PVY积累量低于35S::00对照(图6a)。如35S::MLP28在接种后第9天，与空载体对照相比，系统叶片中侵染区数量和大小明显减少(图6a)。在9天时，35S::MLP28植株的系统叶片与对照相比没有明显的畸形(图6a)。此外，随后的qRT-PCR和western blotting分析结果与PVY感染的严重程度一致。具体来说，35S::MLP28叶片中的PVY水平在3天时比35S::00 叶片降低了约37%，在4天时比35S::00叶片降低了约42%(图6b)，western blotting证实35S::MLP28中的PVY蛋白水平低于35S::00 叶片在3天时的PVY蛋白水平(图6c，补充图5)。综合起来，这些结果支持了NbMLP28过表达增强了烟草对PVY耐受性的观点。

图6.NbMLP28过表达对PVY感染的影响. a.瞬时浸润烟草35::MLP28/PVY-GFP和35::00/PVY-GFP分别在处理3、7和9天观察到紫外荧光差异. b.实时PCR检测接种1、2、3、4天后病毒表达差异. 35S::MLP28/PVY为处理组,35S::00/PVY为对照组. 数据采用SPSS统计学v.21软件进行独立样本T检验,不同字母表示两处理值差异有统计学意义(P < 0.05). c.接种PVY后3天差异检测病毒表达。1-2为接种PVY的35S::00, 3-4为接种PVY的35S::MLP28

NbMLP28在烟草中的过表达促进萌发和根生长

接下来，在野生型烟草的35S启动子下，将MLP28在带RFP标签的框架中组成表达(35S::MLP28::RFP)。利用引物E100F和E100R，通过PCR筛选35S::MLP28::RFP阳性转基因植株(图7a，补充图6)。通过抗生素筛选试验，我们获得T3代纯合子转基因种子，用于后续实验。使用RFP抗体对35S::MLP28::RFP 的T4植株进行免疫印迹(图7b，补充图6)。35S::MLP28::RFP种子在播种2天后开始发芽，而野生型对照没有萌发迹象。第3天，35S::MLP28::RFP种子的发芽率达到45%，而野生型种子的发芽率只有23%。35S::MLP28::RFP植株12天的根系明显长于野生型幼苗，两系的根系形态差异很大(图7e)。35S::MLP28::RFP植株根长平均为2.8 cm，野生型对照植株根长平均为2.0 cm(图7f)。详细的统计分析显示，35S::MLP28::RFP种子与对照种子在播种后3-6天的发芽率有显著差异(图7c)。此外，35S::MLP28::RFP幼苗的鲜重显著高于野生型对照(图7d)。总的来说，这些数据表明MLP28过表达促进烟草种子萌发和根生长。

图7.NbMLP28在转基因烟草中过表达具有促进萌发和生根的作用. a.对选择的高过表达转基因植株进行PCR扩增,样品3为高表达NbMLP28的转基因烟草. b.过表达植株T4代稳定表达RFP标记的MLP28的蛋白检测. c.播后3、4、5、6天过表达NbMLP28转基因烟草和野生型烟草发芽率统计. d.播后12天NbMLP28转基因烟草和野生型烟草过表达鲜重统计. e.播后12天过表达NbMLP28转基因烟草与野生型烟草生长状况的差异. f.过表达NbMLP28转基因烟草和野生型烟草播后12天根长检测

NbMLP28在烟草中对JA信号高度敏感

为了探究NbMLP28在PVY耐受性中的分子基础，我们测量了4周龄烟草在PVY-GFP浸润后SA、JA和ET信号关键基因NPR1、COI1和EIN2的相对表达水平。数据显示，NPR1、COI1和EIN2的表达水平显著影响PVY-GFP的渗透(图8a)，这与之前发现的SA、JA和ET信号通路参与植物病原菌抗性的结果一致。为了测试SA、JA和ET对NbMLP28表达的影响，我们测量了0.5mM SA、0.1 mM Me-JA和0.05 mM乙烯利处理下烟草NbMLP28转录水平。值得注意的是，Me-JA处理显著提高了烟草叶片中NbMLP28的转录水平约0.5倍(图8b)。SA处理使烟草中NbMLP28的转录水平略微降低了0.2倍，0.05 mM乙烯利对NbMLP28的表达影响较小(图8b)。NPR1、COI1和EIN2的沉默效率分别为72%、70%和75% (补充图7)。我们检测了这三种处理下NbMLP28的表达模式，发现NPR1和COI1沉默后NbMLP28的表达量明显减少，在TRV::NPR1和TRV::COI1个体中NbMLP28的相对表达量分别比TRV::00个体低50%和60%。相比之下，EIN2沉默只略微降低了16%的NbMLP28表达(图8c)。同时，与对照组相比，TRV::NPR1、TRV::COI1和TRV::EIN2转基因品系的PVY-GFP表达增强，其中TRV::COI1个体的PVY-GFP表达水平最高(图8d)。综上所述，这些发现表明NbMLP28对JA信号的响应性。

图8.烟草中NbMLP28对激素通路响应的鉴定. a.病毒感染3天后SA、JA和ET的信号转导关键基因NPR1、COI1和EIN2的表达.数据采用SPSS统计学v.21软件进行独立样本T检验,不同字母表示两处理值差异有统计学意义(P < 0.05). b.0.5mM SA、0.1 mM Me JA或0.05 mM乙烯利喷涂后,模拟细胞喷0.02% Tween 20水后NbMLP28的表达情况.数据采用SPSS的邓肯多重极差法进行分析,不同字母表示四种处理的数值有显著差异,P < 0.05,与C、D相同. c.沉默NPR1、COI1和EIN2后NbMLP28的表达. d.沉默NPR1、COI1和EIN2后PVY-GFP的表达

讨论与总结

这是首次在PVY感染的烟草中鉴定出NbMLP28并进行功能分析。此外，我们还分析了其对PVY侵染的防御作用，为构建新的MLP家族候选基因以培育烟草抗病品种提供了坚实的基础。

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