上周四，赛业生物细胞基因编辑生产经理范丽莉「基因敲除细胞蛋白水平验证的挑战和解决方案」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。
FAQ:
1.如何进行基因敲除细胞株的验证以及单克隆的挑选？
2.构建基因敲除细胞系具体的实验难点和原理及注意事项？
3.测序没问题，但一直出现蛋白残留的原因？
4.KO效率只用Tide测序结果证明就可以吗？
5.RT-QPCR验证方法可靠吗？
Q. 如何进行基因敲除细胞株的验证以及单克隆的挑选？
A. 基因敲除策略包括片段敲除和移码敲除两种策略，针对两种策略验证方法不同。
片段敲除鉴定策略：
设计引物PCR扩增三个区域，分别为两个gRNA作用的区域（Region 1和Region 2）和敲除区域（Region 3），如图1。如果gRNA作用的区域无法扩增出条带，而完整的敲除区域扩增出比野生型小的条带，则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。PCR后需进行测序进一步验证。
片段敲除细胞系的鉴定策略
移码敲除鉴定策略：
设计引物PCR扩增包含目的gRNA在内的区域，一般300-500bp，如图2。移码sgRNA敲除通常会产生数量较少的碱基插入或缺失（indel），脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，所以无法鉴定是否产生indel。需要继续对扩增的产物进行测序鉴定。将测序结果与野生型序列进行比对，如果发生非3倍数的indel，则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。
图2 移码敲除细胞系的鉴定策略
关于单克隆挑选，大部分细胞可通过有限稀释法将单细胞铺在96孔板中，培养一段时间后显微镜下观察单克隆形成情况，待单细胞扩增到一定数量再进行单克隆挑选和鉴定。
Q.构建基因敲除细胞系具体的实验难点和原理及注意事项？
A.
基因敲除细胞系构建的原理：
基因编辑技术经历了ZFN,TALEN到CRISPR三代技术革新，相比于ZFN和TALEN，CRISPR拥有简单、价格低廉、易于编程且非常高效的优点，CRISPR已被广泛用于基因编辑。CRISPR制备基因敲除细胞系的原理如下：
Cas蛋白在sgRNA的带领下，切开目标基因组产生双链断裂(DSB)，由于细胞无法在DNA被切断的情况下存活很长时间，细胞内启动修复机制，包括NHEJ和HRR通路，由DNA修复来达成DNA错配，从而造成基因的改变，基因敲除通过NHEJ通路修复产生。
基因敲除细胞系构建的实验难点和注意事项：
1. 分子设计方面：
敲除策略选择不当
基因拷贝数多，gRNA切割不彻底
gRNA设计位置不当，如未能覆盖重要转录本
gRNA设计不当，如效率低，脱靶率高等
致死性分析
解决方法：在分子设计方面结合赛业生物Smart CRISPR基因编辑系统和经验丰富的生信分子团队进行相应的基因分析和设计，确保敲除成功。
2. 细胞方面：
递送方式、培养、转染和单克隆制备困难
解决方法：递送方式建议选择RNP，效率高且低脱靶，摸索细胞培养条件，优化转染方法和单克隆，确保敲除实验前获取最优条件。
3. 鉴定方面：
鉴定策略不合适，筛选不到阳性克隆
Western Blot抗体选择不当
解决方法：根据敲除策略选择合适的鉴定方法，先在基因组水平上进行PCR和测序验证，需具备生信分析经验进行阳性克隆判断和筛选。使用赛业生物RDDC软件进行mRNA水平分析选择产生移码和提前终止的克隆。蛋白水平验证时需要选择KO验证和文献验证的抗体提升Western Blot成功率。
Q.测序没问题，但一直出现蛋白残留的原因？
A.可能的原因有：
1. Western Blot抗体的选择不合适
2. 基因的可变剪切引起的蛋白残留
3. 由于目的基因的多转录本引起的蛋白残留
4. 目的蛋白本底表达低
5. 遗传补偿效应：无义突变和同源序列
参考Western blot trouble shooting思路图进行原因排查
细胞和基因信息分析
1. 确保细胞和基因的准确性。
2. 核对敲除策略和gRNA设计位置，确保gRNA设计在保守区域且尽可能覆盖所有转录本。
3. 分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能会存在遗传补偿效应。
4. 分析目的基因在宿主细胞内的本底表达水平，相应调整Western blot参数。
DNA水平分析
1. 检查鉴定策略是否合适，PCR电泳条带与预期是否一致。
2. 核查测序原始数据，测序质量是否合格，分析测序结果检查是否还有未敲除干净的序列，与野生型序列进行比对确保敲除成功。
mRNA水平分析
两种方法可以在mRNA水平进行验证：
1. 使用赛业生物RDDC软件对突变进行可变剪切预测，如产生移码和提前终止，则认为mRNA水平敲除合格。
2.提取细胞mRNA进行cDNA PCR和测序，并与野生型进行比对，确定mRNA水平是否敲除成功。
蛋白水平分析
根据DNA测序结果，使用相应软件将KO后的DNA翻译成氨基酸序列，并与野生型氨基酸序列进行比对，确定氨基酸水平是否发生敲除。
抗体分析
KO验证和文献验证更优，比对抗体免疫原位点与敲除区域位点，免疫原位点C端优于N端，核对抗体是单克隆或者多克隆，单克隆优于多克隆；抗体的品牌，进口优于国产。
Q.KO效率只用Tide测序结果证明就可以吗？
A
Tide测序结果可以提过一个量化的KO效率，但不能只用Tide测序结果，我们仍然需要对原始的测序原始数据进行分析，需要排除因测序质量差等引起的假阳性结果。所以KO效率的判定需要依据测序原始数据和Tide分析2种方法综合判定。
Q.RT-QPCR验证方法可靠吗？
A
RT-QPCR检查mRNA水平的敲除是可靠的。依照中心法则，DNA分子中的遗传信息转录到RNA分子，再由RNA翻译生成蛋白质。当DNA水平进行验证无问题后，DNA到mRNA的转录也可能会出问题，如形成可变剪切等情况，mRNA的验证也是有必要的。mRNA验证敲除成功后，那么理论上就无法翻译生成正确的蛋白质。
