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今天推荐的是由武汉大学中南医院医学研究所在2019年9月11日发表于Nature Communications（2020IF：14.920，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Hong-Bing Shu教授，研究表明K27连接的多泛素化和去泛素化对TRIF介导的先天免疫反应的调节。

研究背景

含有TIR结构域的接头诱导干扰素-β(TRIF)是由Toll样受体(TLR)3-和TLR4介导的先天免疫反应所需的重要接头蛋白。

摘要部分

在这里，作者将USP19确定为TLR3/4介导的信号传导的负调节器。USP19缺乏会在体外和体内增加由聚(I:C)或LPS诱导的I型干扰素(IFN)和促炎细胞因子的产生。Usp19-/-小鼠在poly(I:C)或LPS治疗后有更严重的炎症，并且在感染鼠伤寒沙门氏菌后更容易受到炎症损伤和死亡。从机制上讲，USP19与TRIF相互作用并催化TRIF K27连接的多泛素部分的去除，从而抑制TRIF向TLR3/4的募集。此外，RINGE3泛素连接酶复合物Cullin-3-Rbx1-KCTD10在K523处催化K27连接的TRIF多泛素化，并且该复合物的缺乏会抑制TLR3/4介导的先天免疫信号传导。因此，作者的研究结果揭示了TRIF K27连接的多泛素化和去泛素化是TLR3/4介导的先天免疫反应的关键调节机制。

研究内容

1.USP19负向调节TLR3/4介导的信号传导

为了鉴定调节TLR3介导的信号传导的去泛素化酶(DUB)，作者通过IFN-β启动子报告基因检测筛选了25个DUB，并将USP19鉴定为候选物。USP19的过表达在293-TLR3细胞中以剂量依赖性方式抑制了聚（I:C）诱导的IFN-β启动子、ISRE和NF-κB的激活。qPCR分析表明USP19的过表达抑制了poly(I:C)诱导的下游抗病毒基因转录，包括IFNB1、ISG56、TNF和CXCL10以及TBK1、p65和IRF3的磷酸化。这些结果表明USP19的过表达抑制了poly(I:C)和LPS触发的IRF3和NF-κB激活。

作者接下来探究了内源性USP19在调节TLR3/4介导的信号传导中的作用。作者构建了USP19缺陷型293-TLR3、293-TLR4细胞。qPCR实验表明293-TLR3细胞中的USP19缺陷增强了poly(I:C)-诱导IFNB1、ISG56、TNF和CXCL10基因的转录。这些数据表明内源性USP19在人和小鼠细胞系中特异性抑制TLR3/4介导的信号传导。

图1.USP19负向调节TLR3/4介导的信号传导

为了研究USP19在体内的功能，作者通过CRISPR/Cas9技术生成了USP19缺陷小鼠。作者首先从野生型和USP19缺陷小鼠中制备了骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)、树突细胞(DC)和小鼠肺成纤维细胞(MLF)。与上述实验一致，作者发现USP19缺陷增强了poly(I:C)-和LPS诱导BMDM和DC中下游效应基因的转录，与野生型相比，聚(I:C)-和LPS诱导的TBK1、IRF3、p65和IκBα磷酸化在Usp19-/-BMDM细胞中显着增加。

图2.USP19在原代细胞中负向调节TLR3/4介导的信号传导

研究结论：USP19在原代小鼠免疫细胞或成纤维细胞中负向调节TLR3/4介导的下游效应基因的诱导。

2.USP19缺陷增强了TLR3/4介导的体内反应

作者接下来研究了USP19在调节TLR3/4介导的体内先天免疫和炎症反应中的功能。Usp19+/+和Usp19-/-小鼠腹腔注射聚（I:C）加D-半乳糖胺或LPS。与Usp19+/+小鼠相比，聚(I:C)-和LPS诱导的IFN-β、TNF、IL-6和CXCL10的产生在Usp19-/-的血清中显着增加。苏木精-伊红（HE）染色分析表明，在注射聚（I：C）加D半乳糖胺或LPS后，在Usp19-/-小鼠的肺部观察到更严重的炎症。与USP19+/+小鼠相比，Usp19-/-小鼠更容易受诱导的炎症性死亡的影响。施用鼠伤寒沙门氏菌后，Usp19-/-小鼠的肝脏和脾脏携带的细菌少于Usp19+/+同窝小鼠。这些结果表明，与野生型小鼠相比，Usp19-/-小鼠清除鼠伤寒沙门氏菌的能力增强。此外，Usp19-/-小鼠产生更高水平的血清TNF和IL-6，小肠绒毛炎症加剧和更显着的体重减轻，并且在施用鼠伤寒沙门氏菌后更容易发生炎症性死亡。

图3.USP19在体内负调节TLR3/4介导的反应

研究结论：USP19缺陷增强了TLR3/4介导的体内先天免疫和炎症反应。

3.USP19从TRIF中去除了K27连接的多聚泛素部分

作者接下来确定了调控USP19对TLR3/4介导的炎症反应的抑制作用的分子机制。报告基因检测表明USP19抑制由TRIF过表达介导的ISRE激活，但不抑制TBK1或IRF3。USP19与TRIF相互作用，但不与哺乳动物过表达系统中的TLR3、TLR4、TRAM、MyD88或TBK1相互作用。域映射实验表明，TRIF的TIR（aa348-580）和C端域（aa532-712）可以独立地与USP19相互作用。另一方面，USP19的C端USP而不是N端串联CHORD-SGT1（CS）结构域具有与TRIF相互作用的能力。一致地，缺乏USP结构域的USP19突变体也失去了抑制聚（I：C）和LPS触发的IFN-β启动子激活的能力。内源性USP19与未刺激细胞中的TRIF相关，并且它们的关联在poly(I:C)或LPS刺激后增加。这些结果表明USP19在TRIF水平上起作用。

图4. USP19作用于TRIF水平

由于USP19是一种去泛素化酶，作者接下来确定它是否去泛素化TRIF。作者发现USP19的过表达而不是其酶失活突变体USP19（C607S）从TRIF中去除了多聚泛素部分。相反，在Usp19-/-中增加了TRIF的多泛素化。这些数据表明USP19通过去泛素化TRIF发挥作用。作者接下来确定了USP19去除的TRIF泛素链的类型。通过将TRIF与仅包含单个赖氨酸残基(KO)的泛素突变体共转染，作者发现USP19从TRIF中去除了K27连接的多聚泛素部分。通过将TRIF与泛素突变体共转染，作者发现USP19仅当K27突变为精氨酸时才能从TRIF中去除多聚泛素部分。这些结果表明USP19使来自TRIF的K27连接的多泛素部分去泛素化。一致地，与在poly(I:C)或LPS刺激后的USP19+/+细胞相比，在USP19-/-中TRIF的K27连接的多泛素化显着增加。

图5.USP19从TRIF中去除了K27连接的多聚泛素部分

研究结论：在TLR3/4激活后，USP19特异性地从TRIF中去除了K27连接的多聚泛素部分。

4.TRIF的去泛素化会影响其向TLR3/4的募集

作者接下来确定了USP19介导的TRIF去泛素化如何损害TLR3/4信号传导。在哺乳动物过表达系统中，USP19破坏了TRIF和TLR3之间的相互作用，但对TRIF和TBK1或TRAF3之间的相互作用没有显着影响。在类似的实验中，USP19(C607S)对TRIF-TLR3和TRIFTBK1相互作用没有显着影响。内源性共免疫沉淀实验表明，在聚（I:C）刺激后，更多的TRIF被募集到USP19缺陷的293-TLR3细胞中的TLR3。这些结果表明，在TLR3激活后，USP19以去泛素化酶活性依赖的方式削弱了TRIF与TLR3的关联。

图6.USP19介导的TRIF去泛素化会损害其功能

在免疫和炎症反应中，作者试图确定介导K27连接的TRIF多泛素化的E3泛素连接酶。作者通过报告基因检测筛选了八种候选物，它们具有增强聚（I：C）触发和TRIF介导的IFN-β启动子激活的能力。随后作者敲除293-TLR3细胞中的这些候选蛋白。作者发现KCTD10、HERC4、RNF13或RNF72的缺陷显着抑制了poly(I:C)触发的IFNB1基因转录。在哺乳动物过表达系统中，KCTD10强烈介导K27连接的TRIF多泛素化。内源性免疫共沉淀实验表明KCTD10与未刺激细胞中的TRIF相关。此外，与对照细胞相比，在KCTD10缺陷细胞中，poly(I:C)-和LPS诱导的K27连接的TRIF多泛素化显着降低。KCTD10是Cullin-3-Rbx1-KCTD10RINGE3连接酶复合体中的底物特异性接头。一致地，KCTD10介导的K27连接的TRIF多泛素化在Cullin3和Rbx1缺陷细胞中被消除，表明KCTD10介导的TRIF多泛素化依赖于Cullin-3和Rbx1。

图7.Cullin-3-Rbx1-KCTD10催化K27连接的TRIF多泛素化

研究结论：Cullin-3-Rbx1-KCTD10E3泛素连接酶复合物通过催化TRIF的K27-连接的多泛素化来介导TLR3/4介导的信号传导。

5.TRIF的Lys523被K27连接的多泛素化修饰

作者进行了系统的赖氨酸(K)到精氨酸(R)突变扫描，并在报告基因检测中测试了USP19对其ISRE激活的影响。USP19显着抑制由野生型和所有测试的TRIF突变体介导的ISRE激活，但TRIF（K523R）除外。在这些实验中，作者还注意到与野生型和其他检查的突变体相比，TRIF（K523R）激活ISRE的能力显着降低。作者通过将TRIF(K523R)重组为缺乏TRIF的293-TLR3细胞，进一步研究了TRIF(K523R)的功能。作者发现与野生型TRIF和TRIF(K529R)相比，TRIF(K523R)部分失去了介导poly(I:C)触发的下游IFNB1和CXCL10基因诱导的能力。进一步的实验表明K523消除了其K27连接的多泛素化。在类似的实验中，TRIF的K63连接的多泛素化在野生型TRIF与其K523R、K415R和K529R突变体之间具有可比性。此外，KCTD10催化野生型TRIF和TRIF（K529R）而不是TRIF（K523R）的K27连接的多泛素化。

图8.TRIF的K523被K27连接的多泛素化修饰

研究结论：Cullin-3-Rbx1-KCTD10E3连接酶在K523处催化K27连接的TRIF多泛素化。

结论与讨论

在这项研究中，作者将USP19鉴定为TLR3/4信号传导的负调节因子。基因敲除研究表明, USP19在细胞和小鼠中负向调节TLR3/4介导的先天免疫和炎症反应。生化研究表明, USP19在TLR3/4激活后特异性去除TRIF的K27连接的多泛素部分，其缺陷会抑制TLR3/4介导的先天免疫信号传导。这些发现表明,TRIF的K27连接的多泛素化调控是TLR3/4介导的信号传导的关键调节机制，其在微调TRIF介导的先天免疫和炎症反应方面具有重要功能。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-12145-1