外泌体是一种由大多数(如果不是全部)细胞分泌的纳米级、脂质膜包裹的小囊泡，直径约30-150纳米。它们被丝状伪足吸收为单个颗粒，并花费大量时间与内质网相互作用。相比之下，LNP通过内吞作用被细胞吸收，并且脂质在低pH值下的电离性使得一些货物内体释放进入细胞质。LNP作用机制中包括定位和内体的破坏，通常会触发先天免疫识别传感器。

近年来，外泌体作为一种潜在的纳米递送系统，引起了广泛的关注。外泌体可以携带多种生物分子，包括蛋白质、核酸和代谢产物等，并通过与受体细胞的相互作用，实现这些分子的有效递送。其中，外泌体递送mRNA被认为是一种具有巨大潜力的治疗策略，可以用于基因治疗和免疫治疗等领域。

外泌体细胞摄取和内化途径与脂质纳米颗粒对比 图源：医麦客

由于外泌体具有独特的理化特性优势，它自诞生起就被视为一位“超级快递员”。不仅没有免疫原性，毒性也很低，而且能够渗透到组织和扩散到血液中，甚至穿过血脑屏障。目前已经证实，外泌体能够自然运输各种细胞代谢产物，例如蛋白质、脂质、转录因子、miRNA和mRNA。正是由于外泌体作为“自然运载工具”的这种自然作用，引发了许多对其潜在治疗用途的开发兴趣。

脂质体是一种由磷脂双层组成的纳米颗粒，可以包封mRNA，并保护其免受降解。脂质体包封法可以通过电击、超声波或化学方法等手段，将mRNA包封在脂质体内。这种方法具有简单、高效、可大规模生产等优点，被广泛应用于外泌体递送mRNA的研究中。

聚合物是一种聚合物纳米颗粒，可以通过静电相互作用或共价键结合等方式包封mRNA。聚合物包封法可以调控外泌体的大小、形状和表面性质，从而实现对mRNA的高效包封和递送。此外，聚合物还可以通过改变其化学结构，增强外泌体与受体细胞之间的相互作用，提高递送效率。

除了脂质体和聚合物，还有一些其他包封方法被用于外泌体递送mRNA的研究。例如，磁性纳米颗粒可以通过磁力作用将mRNA包封在外泌体内，并实现靶向递送。此外，一些新型的包封方法，如碳纳米管和金纳米颗粒等，也被应用于外泌体递送mRNA的研究中。

将mRNA装入细胞来源的囊泡的策略可以分为两种主要方法：预加载法和后加载法。预加载法又分为被动方法和主动方法。在被动方法中，细胞自然地将mRNA货物封装到细胞来源的囊泡中。有时，这种内源性加载过程也会将mRNA编码的蛋白质一同包装到细胞来源的囊泡中。另一方面，主动方法依赖于细胞内部的生物发生过程，主动将mRNA货物装载到细胞来源的囊泡中。后加载法，也称为分离后或外源性加载方法，主要是通过电穿孔或化学转染试剂将外源性mRNA装载到分离的囊泡中。

图源：生物在线

被动预加载方法是引入质粒到生产细胞中，以促进目标mRNA的转录并使其在囊泡中富集。此策略已被用于将不同的mRNA加载到囊泡中。例如，通过在源细胞中过表达低密度脂蛋白受体(Ldlr)mRNA，使其封装到囊泡中。转染质粒后，源细胞中Ldlr mRNA的水平比转染对照质粒的细胞增加了100倍以上，导致分泌的囊泡中mRNA含量也相应增加。尽管将大型mRNA封装成纳米囊泡在技术上具有挑战性，但这种策略不仅提高了囊泡的产量，还提高了囊泡中的mRNA含量。此外，与传统的电穿孔方法相比，这种策略也增加了mRNA进入囊泡的负荷。

另一种提高mRNA装载效率的一种策略是利用两种质粒进行转染。其中一种质粒产生由mRNA结合成分和囊泡富集蛋白构成的融合蛋白，例如CD9、CD63等表面标志物或Hspa8等细胞膜蛋白。该融合蛋白能从感兴趣的mRNA中识别并绑定特异性位点，从而预加载活性mRNA。另一种主动加载平台名为靶向和模块化囊泡加载(TAMEL)，它将囊泡富集蛋白融合到MS2噬菌体外壳蛋白上，从而将mRNA主动加载到囊泡中。随后，通过整合同源的茎环序列到mRNA载体中，促进其结合并加载，避免了文本的重复。

目前，将mRNA装载到EV主要依靠后加载方法，包括电穿孔和商业试剂。电穿孔是一种常见技术，能将siRNA、miRNA和mRNA等不同分子装载到纯化的EV中。据估计，约五分之一的Cas9 mRNA可以通过电穿孔技术装载到来自红细胞的EV中。此外，还有一种名为REG1的商业装载试剂，可用于将分离后的mRNA装载到EV中

外泌体的表面可以通过修饰分子来实现靶向递送。例如，通过共价键结合或静电相互作用，可以将靶向配体(如抗体、寡核苷酸等)固定在外泌体表面，从而实现对特定受体细胞的靶向递送。此外，还可以通过改变外泌体的表面电荷、大小和形状等特性，来增强其在受体细胞上的识别和吸附能力。

外泌体递送mRNA的靶向策略主要包括主动靶向和被动靶向。主动靶向是指通过表面修饰的靶向配体，主动地与受体细胞上的受体结合，实现mRNA的特异性递送。被动靶向是指外泌体通过改变其物理和化学特性，利用受体细胞的特异性吸附和摄取机制，实现mRNA的选择性递送。

生物反应器策略是一种新型的外泌体递送mRNA的靶向策略。通过将外泌体与特定的细胞或组织共同培养，可以利用其自身的分泌功能，将mRNA递送到特定的细胞或组织中。这种策略具有高效、可控和可重复使用等优点，被认为是一种有潜力的外泌体递送mRNA的靶向策略。

图源：数谱生物

为了增强外泌体的组织特异性，人们提出了几种策略包括：

(A)依赖miRNA的mRNA表达;

(B)辅助超声波传递;

(C)靶向肽融合蛋白;

(D)乳清蛋白-磷脂酰丝氨酸相互作用;

(E)酶促共价结合。

最新研究显示，肝脏特异性的miRNA-122能够识别丙型肝炎病毒RNA的5’端内部核糖体进入位点(IRES)，从而启动肝脏中特定mRNA的翻译过程。通过将IRES上的miR-122识别位点替换为其他组织特异性miRNA的识别序列，可以实现特定组织中mRNA的miRNA特异性激活。研究人员利用这一原理，用miR-148a的识别序列替换了PGC1α mRNA编码序列上游的miR-122识别位点，构建了脂肪特异性翻译系统(miR-148a-IRES-PGC1α)。通过注射这种系统的外泌体，观察到小鼠脂肪组织中PGC1α蛋白的显著增加，而肺、脾和肾中的表达则下降。类似地，miR-155富集的miR-122替代Il-10 mRNA的系统也被构建，并在动脉粥样硬化炎症部位应用。在炎症巨噬细胞中，miR-155特异性激活了Il-10 mRNA的表达，而在其他非炎症组织中的表达较低。

图源：医麦客

为了降低脱靶效应，一种超声辅助外泌体递送的方法被开发出来。最近，已经研制出两种超声辅助外泌体平台，能将mRNA精准地传递至脂肪组织。一项研究利用超声靶向微泡破坏(UTMD)和组织特异性miRNA依赖的表达系统，成功实现了外泌体的定向摄取。UTMD不仅可以增强细胞膜的通透性，还可以促进受体细胞对外泌体的吸收，从而有助于外泌体进入脂肪组织。与这一理论相符的是，在UTMD的帮助下，标记了UTMD的外泌体在脂肪组织中的分布显著增加。

通过基因工程、酶或基于亲和的方法，可以将靶向配体结合到外泌体囊泡(EV)上，这已被证实是实现基于外泌体的靶向传递的有效途径。例如，将中枢神经系统特异性狂犬病毒糖蛋白(RVG)与外泌体膜蛋白Lamp2b融合，能促进融合蛋白RVG-Lamp2b通过血脑屏障的转运。为了将EV靶向递送至脂肪组织，将一个脂肪细胞靶向序列(ATS)融合到Lamp2b的N端。此外，将抗HER2单链可变片段连接到一个乳酸黏附素前导序列。前者能够通过与HER2过表达细胞的抗原-抗体相互作用来靶向，而后者则通过与EV表面的磷脂酰丝氨酸结合来与EV结合。因此，修饰后的EV能够被HER2阳性细胞选择性地内化。虽然融合蛋白的方法比较直接，但是其靶向方法需要进行基因工程。

另外一种靶向修饰EV的方法是不对源细胞进行任何基因修饰，将多肽或纳米体与EV共价偶联。这种通用型靶向平台利用蛋白连接酶催化EV膜蛋白和靶向配体之间的共价键反应，包括靶向肽、"自身"肽和纳米体。

外泌体递送mRNA作为一种新型的纳米递送系统，具有广阔的应用前景。通过选择合适的包封方法和靶向策略，可以实现对mRNA的高效递送，并在基因治疗和免疫治疗等领域发挥重要作用。然而，外泌体递送mRNA的研究仍处于起步阶段，还需要进一步的研究和优化。相信随着技术的不断改进和发展，外泌体递送mRNA将为疾病治疗带来新的突破。

文章来源：合联启程GMP公众号