研究背景
▶▶▶
联合HER2靶向治疗的新辅助化疗疗法显著提高了早期HER2阳性乳腺癌的病理完全缓解(pCR)率。尽管如此，高达50%的患者在治疗后仍有残留，而其他患者则可能被过度治疗。虽然在早期HER2阳性乳腺癌中，许多生物标志物被认为可以帮助指导个性化靶向治疗，包括影像学方法、循环肿瘤DNA和治疗前免疫评分，但目前还没有十分有效的生物标志物可以指导患者分层。
在最近一项研究中，来自美国斯坦福大学药学学院的研究团队在Nature Cancer上发表题为“Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response”的空间蛋白组学研究，证实了经过一个周期HER2靶向治疗后的空间蛋白组的变化信息可以很好地帮助预测临床获益，即最终会达到病理完全应答（pCR）的肿瘤患者。相比于完全基于治疗前的评估数据或者检测全转录组水平的变化，这种基于一周期用药后的空间蛋白组学变化特征的预测方法展示出更优异的表现。
NO.1 研究样本
该项目所采用的样本是来自新辅助疗法TRIO-US B07临床队列中57名HER2阳性的乳腺癌患者的122个组织样本，这些样本取自三个阶段：治疗前样本（Pre-treatment）；经过14-21天的HER2靶向治疗的样本（After 14–21 d of HER2-targeted therapy）；手术切除的样本（Surgery）。
Fig. 1 | a, Schematic overview of the discovery and validation cohorts analyzed with the GeoMx DSP technology.
•Discovery Cohort：28位病人的所有三个阶段（pre-treatment, on-treatment and at surgery）的FFPE样本。该队列选取考虑了对pCR和雌激素受体状态的平衡（Extended Data Fig. 1a,b），并用于该研究项目的所有探索性分析。
• Validation cohort：该队列中的29名患者pre-treatment和on-treatment阶段的FFPE样本，用来评估模型的表现。
NO.2 所用平台和技术策略
Extended Data Fig. 2 | a. Overview of NanoString DSP workflow adapted with permission from NanoString.
空间组学技术平台：GeoMx DSP；
Fig. 1 | b, Multiple ROIs per tissue sample were selected based on pan-CK enrichment and subjected to spatial proteomic profiling of 40 tumor and immune markers. Protein counts were measured within phenotypic regions corresponding to the pan-CK-enriched masks that included tumor cells and colocalized immune cells and separately for the inverted mask corresponding to pan-CK-negative regions.
多重靶标定量技术：nCounter；
Panel：40 Tumor and immune proteins；
NO.3 研究结论
通过对样本中多个Pan-CK富集区域中40种肿瘤和免疫蛋白的检测，分析了乳腺癌治疗前样本的空间异质性，以及对应的在治疗过程中以及治疗后样本中肿瘤信号通路和微环境的变化。结果发现，最终取得pCR的肿瘤患者，在治疗过程中的的蛋白表达发生了显著变化。基于该结果并结合Discovery Cohort数据集的训练，研究团队开发出了一套用于肿瘤个性化检测进而帮助指导治疗决策的分析工具，并比较发现相比于基于转录组数据的预测模型，该Classifier有更好的预测表现，同时还可以预测PAM50亚型和TILs。同时，在Validation cohort中，该模型的表现也得到了验证。
值得关注的是，研究人员发现仅凭CD45一种蛋白标志物在治疗过程中的表达模式就可以精准的地对治疗响应结果进行预测（这一发现用CD45免疫组化方法得到了证实）。总的来说，这些结果为早期HER2阳性乳腺癌的个性化治疗提供了新的途径。
——【研究结论 一】 ——
HER2阳性乳腺癌空间蛋白组学分析
（Pre-treatment Samples）
研究结论 一：
在未经治疗（Pre-treatment）的肿瘤样本中，免疫标志物之间的相关性非常显著，这表明多个免疫细胞亚群间存在一定的协同作用（Fig. 1c）。同样的，HER2通路成员与其他下游肿瘤信号标志物也高度相关。但大多数肿瘤标志物与免疫标志物相关性很小。
Fig. 1 | c, Pairwise correlation of pre-treatment protein marker expression across all ROIs in the discovery cohort. The black squares indicate probes in the same hierarchical cluster.
针对未经治疗（Pre-treatment）的样本，将每个标志物在所有ROI中的表达水平取均值，得出每个marker的综合评分，结果发现最终获得pCR的肿瘤患者样本和non-pCR样本中，他们的HER2和CD45的表达水平基线非常类似接近。
Fig. 1 | d, Inter- and intratumor variability in HER2 and CD45 protein expression in n = 28 untreated HER2-positive breast tumors from the discovery cohort, where each point corresponds to an ROI. Clinical characteristics, including pCR status, estrogen receptor status and PAM50 subtype (based on gene expression profiling) are indicated. Cancer signaling and immune changes after short-term therapy.
——【研究结论 二】 ——
短期治疗后的癌症信号通路和免疫微环境变化
（On-treatment Samples）
研究结论 二：
为探究哪些肿瘤信号通路和免疫微环境受到治疗的影响（对治疗有响应），研究人员利用DSP针对Discovery cohort中接受短期HER2靶向治疗的样本获取了40种蛋白的表达谱，并进一步研究了和治疗相关的表达谱变化是否会最终反映到HER2靶向治疗的敏感性（即在新辅助疗法后是否获得pCR），如果可以，那么就可以利用治疗过程中的表达普遍化来辅助病人的分层（Fig. 2b）。
Fig. 2 | Spatial proteomic analysis reveals changes in cancer signaling and immune infiltration after short-term HER2-targeted therapy.
研究人员发现，在pCR病例中，有大量的免疫标记物随着治疗而表达增加，而在non-pCR病例中，没有观察到显著的免疫表达增加。而肿瘤标志物和信号通路，如Ki67和HER2的表达也没有明显降低。
通过比较的蛋白质标记间的的相关性也可以体现出上述模式特点，在pCR样本中免疫标志物和肿瘤标志物的表达呈现出明显的负相关。而在治疗前的数据中并没有体现出在pCR和non-pCR中的表达差异模式（Fig. 2c）。
——【研究结论 三】 ——
HER2靶向治疗的过程增加了样本的异质性程度
（On-treatment）
研究结论 三：
鉴于基因组异质性是HER2阳性乳腺癌的一个决定性特征，研究人员接下来探究了经过新辅助治疗后，在同一样本的不同区域中以及患者之间HER2蛋白表达的差异程度。
Fig. 3 | Increased heterogeneity of tumor and immune markers during HER2-targeted therapy. b, Comparison of DSP HER2 protein levels pre-treatment and on-treatment for all regions profiled per case per time point (n = 28 patients). c, Comparison of the mean squared error in DSP HER2 protein expression pre-treatment versus on-treatment within and between patients.
针对大多数pre-treatment的样本，HER2蛋白在同一样本中的不同区域的表达水平差异不大。但在on-treatment的样本中，则观察到同一样本不同区域以及不同样本间的相对明显的HER2蛋白表达差异。CD45也表现出类似的模式（Fig. 3b, 3c）。这种区域异质性一定程度上也反映了由于血管系统、组织结构、免疫浸润而导致的药代动力学差异，也再次强调了在治疗时对每个样本进行空间多区域原位分析的重要性。
Fig. 3 | Increased heterogeneity of tumor and immune markers during HER2-targeted therapy. d, Pre-treatment versus on-treatment heterogeneity for each DSP tumor and immune marker. e, On-treatment heterogeneity in DSP protein markers for pCR and non-pCR cases. Heterogeneity was calculated as the mean squared error within patients based on ANOVA in c–e. P values are based on a two-sided paired Wilcoxon signed-rank test. Analyses are based on the discovery cohort (n = 28 patients).
研究人员同样也评估了在non-pCR的病例样本中，新辅助治疗过程中的异质性变化，发现non-pCR病例样本中，肿瘤标志物的异质性在治疗期间和治疗前均无显著差异；相反的，最终获得pCR的病例样本，在治疗期间肿瘤标记物显示出更高的异质性。
Extended Data Fig. 7 | Comparison of immune markers in panCK-enriched and panCK-negative regions.
研究人员进一步探究了在Pan-CK-enriched区域相对于周围Pan-CK-negative区域，在免疫细胞组成上的差异，进而帮助获取周围微环境的信息。在治疗前，T细胞（包括CD3、CD4、CD8）和巨噬细胞（CD68）标记物在周围微环境中均普遍存在，而CD56-positive NK细胞和免疫抑制标记物（如B7-H4 (VCTN1)、PD-L1、IDO）则在Pan-CK-enriched区域分布更集中分布。这些发现在一定程度与T-cell exclusion现象一致，IDO和PD-L1会减弱效应T细胞在肿瘤组织内的增殖。
重要的是，相比于使用空间组学方法单独观察特定区域，如Pan-CK-enriched区域，如果从整个组织水平来观察，这些表达差异就会被掩盖掉。以上的这些数据进一步支持了Pan-CK的富集可能有助于确定乳腺癌和其他肿瘤中肿瘤和局部免疫改变。
——【研究结论 四】 ——
DSP蛋白空间表达谱能够反映和pCR相关的特征
研究结论 四：
鉴于treatment-associated的变化在non-pCR病例和pCR病例中体现出的显著差异（Fig. 2 b），研究人员尝试评估DSP蛋白在治疗前或者治疗早期的表达模式状态是否能够用来预测pCR。虽然多种因素可能影响蛋白质和RNA表达水平之间的相关性，比如Pan-CK富集、RNA transience/degradation和翻译后调控，但是蛋白表达数据是更接近细胞表型的解读。
研究人员得到了依据蛋白在pre-treatment和on-treatment的表达特征来预测pCR或non-pCR的分类模型。在该分类模型中观察到CD45标记在on-treatment的特征值的系数最大（Fig. 5 b），进而研究人员尝试评估使用CD45这个单一marker来评估模型性能表现。结果发现，DSP CD45 on-treatment模型在训练队列和验证队列中都展现出很好的表现，可以可靠地预测病人的最终获益，这对帮助敏感肿瘤的早期分层，优化、制定后续的治疗方案具有指导意义。
Fig. 5 | Validation of the DSP-based spatial proteomic biomarker in an independent cohort. b, Coefficients for each of the 40 markers in the L2-regularized on-treatment + pre-treatment DSP protein model, trained in the discovery cohort and tested in the validation cohort.
Fig. 6 | On-treatment IHC-based measurement of percentage CD45-positive cells in tumor-enriched regions is associated with pathological complete response. b, ROC curves for classifiers trained using either on-treatment DSP CD45 levels or on-treatment IHC-based CD45-positive percentage of cells. These models were evaluated on the subset of cases on which CD45 IHC was performed (n = 28 biologically independent tumors).
NO. 4 总结展望
近年来，基因组和转录组分析一直是癌症生物标志物发现的主要手段。然而，组织异质性使这些数据的分析变得非常复杂。尤其是在纵向时间轴上研究样本时，细胞群的组成和空间分布的变化很可能反映了疾病进展或治疗反应机制，这时基因组和转录组分析面临的问题就更加突出。通过该项目，研究人员发现，通过对治疗过程中肿瘤免疫微环境进行原位的蛋白质组分析，可以规避现有技术方法的局限性，提高发现新辅助HER2靶向治疗相关特征的能力。
在这项研究中，研究人员使用DSP技术，对新辅助HER2靶向治疗前、中和后的乳腺肿瘤样本进行40个肿瘤和免疫蛋白标记物的分析。为了增强信号，同时考虑肿瘤内异质性，研究人员采用了Pan-CK masking的策略，实现在不同的区域（ROI）来着重观测肿瘤细胞和免疫微环境。该研究结果证实了通过对组织样本进行多重原位蛋白质组学分析从而为治疗提供肿瘤和免疫细胞信息变化特征的可行性和巨大优势。
