一直以来 RNA 水平的核酸编辑被认为是一种治疗遗传疾病的有效技术，可以挽救与疾病相关的序列以产生功能性蛋白质产品，是热点所在。近年来研究正热的Cas13蛋白在crRNA的引导下可以特异性编辑RNA。今天小恒给大家整理的正是关于Cas13的作用机制及应用现状，供大家参考。
CRISPR-Cas13系统属于Type VI家族，包括Cas13a、b、c、d等多个亚型。Cas13蛋白都是由多结构域组成的单一蛋白，具有识别crRNA、切割RNA、甚至是切割pre-crRNA的功能。Cas13蛋白具有2个标志性的HEPN结构域，2个R-XXXX-H保守基序是HEPN结构域的核酸酶活性位点。除了Cas13蛋白外，Type VI家族基因位点上还包含CRISPR array。CRISPR array由重复序列（Repeat）和间隔序列（spacer）组成，CRISPR array转录形成未成熟的pre-crRNA，经切割形成成熟的crRNA，引导Cas13蛋白发挥功能。
图1 CRISPR-Cas13家族分类图，图片来源Kordyś M al et, 2022
CRISPR/Cas13系统功能机制：
与CRISPR-Cas9/12系统一样，CRISPR-Cas13系统在其天然宿主中的作用机制包括适应、表达和干扰。在表达阶段，产生crRNA和效应核酸酶。CRISPR阵列被转录为前crRNA转录本，该转录本由Cas13的REC叶加工成crRNA。与II型Cas9不同，它不需要反式激活(tracr)RNA或内源性RNase H。而且，pre-crRNA相对于II型具有简单的结构。DR区域形成一个发夹，两侧有大约20-30nt间隔序列，间隔序列为50（VI-B、VI-X和VI-Y）或30（VI-A、VI-C和VI-D）。crRNA内的间隔区对特定靶RNA具有特异性，并介导其识别。处理后，成熟的crRNA包含DR和间隔区。在靶标RNA被Cas13:crRNA复合物识别并结合之前，基本不具备裂解活性。与靶RNA形成三元复合物后，构象重排随之发生，从而使crRNA：靶RNA杂交体完全被核酸酶核心包围，并且催化激活核酸酶。在crRNA内，可以识别一些子区域，其中之一是种子区域。它与靶RNA的完美互补性对于靶RNA的有效结合和切割至关重要。与Cas9不同的是，Cas13蛋白不需要PAM序列来识别其靶标，但对临近基序区域两侧表现出核苷酸偏好，并将其称为ProtSpacer侧翼(PFS)。推荐设计Cas13系统gRNA的在线网站：CHOPCHOP，（http://chopchop.cbu.uib.no）。
Cas13蛋白功能非常重要的另一机制是在靶识别时，Cas13：crRNA不仅会切割目标RNA，而且会非特异性切割附近存在的RNA，这一机制与上一期讲的Cas12蛋白非常相似，被称为反式切割。因此，它还可以降解邻近的其他RNA。与DNA靶向系统不同，Cas13a不会摧毁入侵者，而是通过引起强大的反式切割效应诱导细胞休眠，从而导致宿主的非特异性免疫，从而防止病原体进一步传播。
图2 CRISRP-Cas13作用机制，图片来源Kordyś M al et, 2022
CRISPR-Cas13系统的应用：
1、核酸检测：CRISPR-Cas13系统与crRNA、底物结合形成三元复合体后，Cas13蛋白被激活，此时Cas13蛋白不仅能切割底物RNA，还能切割游离在环境内的任意单链RNA，即反式切割现象。在反应体系中加入大量信号报告分子，该分子一端连有荧光基团，另一端连有猝灭基团，正常情况下报告分子不发出荧光。当Cas13蛋白-crRNA二元复合体识别底物RNA后，Cas13蛋白被激活，除了特异性地切割底物RNA，还会非特异性地切割环境内的报告分子，释放信号。
图3 SHERLOCK检测原理示意图，图片来源Kellner MJ al et, 2019
2、RNA成像：研究人员对Cas13蛋白HEPN结构域R-XXXX-H基序进行突变，得到dCas13蛋白。dCas13蛋白丧失切割酶活性，但保留了结合酶活性，因此能够靶向目标RNA分子。目前有3种基于CRISPR-Cas13系统的RNA成像工具：Broad研究所张锋团队研发的dLwaCas13a-msfGFP融合蛋白、用于LncRNA失踪的dPspCas13b-EGFP、进行活体转录本成像的CRISPR Live FISH技术。
图4 LwaCas13a-msfGFP成像原理，图片来源Abudayyeh OO al et, 2017
图5 dPspCas13b-EGFP成像原理及示意图，图片来源Yang LZ al et, 2019
图6 CRISPR LiveFISH示意图，图片来源Wang H al et, 2019
3、转录组调控：在dCas13蛋白上融合各种效应蛋白，能够实现各种针对RNA的调控：m6A甲基化调控，如dCas13-METTL3和dCas13-METTL3/METTL14融合蛋白，可实现特定位点的RNA甲基化。dCas13-ALKBH5融合蛋白，实现特定位点RNA去甲基化。
图7 Cas13-METTL3和dCas13-METTL3/METTL14原理示意图，图片来源Wilson C al et, 2020
CRISPR/Cas13系统对于研究重要基因、基因特定转录本、非编码RNA、RNA碱基修饰等至关重要，拥有极大的研究前景，目前学者们对Cas13酶的探索仍在不断进行中。汉恒专营工具病毒十余载，可定制各种质粒以及病毒工具，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！
参考文献：
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