时隔一期,伯小远带着基因功能研究的干货又和大家见面啦!咱们话不多说,直入主题吧!
在上上一期的文章中,伯小远对基因的结构进行了分析,在对基因的结构有所了解之后,咱们再来讨论基因的功能如何研究会更容易理解哦!
基因功能的研究策略主要包括哪些呢?
1、应用生物信息学分析软件或数据库进行结构和功能的预测;
2、基因的体内表达规律分析;
3、亚细胞定位分析;
4、转基因研究;
5、基因编码产物相互作用蛋白的研究。
图1 生物信息学应用于蛋白质相互作用
mRNA水平的表达分析
图2 在高磷和低磷条件下,GmSPX基因在不同部位的表达水平
蛋白质水平的表达分析
很多研究指出,细胞内特定基因的mRNA水平变化和蛋白质水平变化的一致性很差,即便知道了全部基因的表达情况,也不能反映基因功能的体现者和行使者——蛋白质的实际合成情况,因此难以阐明基因的实际功能。因此基因组计划开始转向了蛋白质终产物的表达情况研究。这种在蛋白质水平上的表达分析最常用的技术是Western Blotting。
Western Blotting与前述的Nortern Blotting类似,不仅可以进行定量分析,而且还可以检测蛋白质的分子量大小及聚体形式。免疫组化技术则能够准确地检测蛋白质在特定生物体或组织、细胞中的具体表达位置,是研究蛋白质定位、定量的重要方法,并且特异性强,灵敏度高。
图3 VRN2-FLAG、FIE-HA、VIN3-HA蛋白表达随时间变化
一般情况下我们在对基因的功能进行预测之后,对于该基因的亚细胞定位也会做一个预测,由于亚细胞定位能较快拿到实验结果,所以会首先做一个亚细胞定位分析,根据实验结果,一方面可以验证预测是否正确,另一方面可以帮助我们分析其可能的功能。了解蛋白的亚细胞定位对于研究基因的功能、蛋白互作及其作用机理是必要的。
目前比较常用的就是将目标基因与荧光蛋白的N端或者C端融合,通过瞬时转化技术使该融合蛋白在受体材料细胞内表达,通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置确定目标蛋白的位置,从而确定目标蛋白的亚细胞定位情况。
图4 GmVTL1a在烟草原生质体中的亚细胞定位
生物信息学分析在对基因功能进行合理的预测后,又做了亚细胞定位分析,但是这些仅仅只能对基因的功能有一个大致推断,在一定程度上需通过试验方法进行验证,并进一步外延生物信息学研究的结果。验证方法一般都会用到转基因技术,基因功能研究至少可以包括以下几种类型转基因与基因敲除材料的构建:
(2)恢复基因表达:功能互补
图6 在突变体中恢复PTOX基因使得表型恢复
(3)敲除基因:CRISPR
图7 敲除GmVTL1基因导致根瘤发育缺陷
(4)反义技术
反义技术是指通过碱基互补配对原理,利用人工或生物合成的特异互补性DNA或RNA片段(或其修饰产物),干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节,抑制或封闭靶基因的表达,从而调节细胞的生长分化等。反义技术主要包括反义寡核苷酸技术(Antisense oligonucleotides, ASON)、核酶技术(Ribozyme)和小干扰RNA。
(5)RNAi
①来源不同:miRNA是生物体的固有因素,是内源性的,而siRNA是人工体外合成后通过转染进入体内的,是RNAi的中间产物;
②结构不同:miRNA为单链RNA,而siRNA是双链RNA;
③Dicer酶对两者的加工过程不同,miRNA是由不对称加工形成的,仅是剪切前体miRNA的一个侧臂,其它部分降解,而siRNA对称地来源于双链RNA前体的两个侧臂;
④作用部位不同:miRNA主要作用于靶基因mRNA的3’UTR区域,而siRNA可作用于靶基因mRNA的任何部位;
⑤作用方式不同,miRNA既可抑制靶基因mRNA的翻译,也可以导致靶基因mRNA降解,即在转录后水平和翻译水平起作用,而siRNA只能导致靶基因mRNA的降解,为转录后水平调控;
⑥miRNA主要参与内源基因的调节和细胞发育过程,而siRNA的原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
图8 miRNA的生物发生
(5)启动子分析
图9 MIR167a和MIR167b启动子活性分析(O-Y)
今天的干货就分享到这里啦,下面做一个简单的总结,这一期伯小远主要介绍了研究一个基因的功能,一般会先进行生物信息学分析,然后对基因的功能进行预测,做亚细胞定位分析,最后利用转基因技术实验对基因功能进行验证研究,下期咱们会分享基因编码产物相互作用蛋白的研究,想知后续如何,请关注伯远生物公众号,伯小远和您不见不散!希望有了伯小远的陪伴,您的科研之路越走越顺!