双荧光素酶报告基因检测实验在之前的推文中给大家介绍过多次，但小远发现大家对于这个实验该如何设置实验组与对照组似乎总是搞不太清楚，因此小远专门找了文献来给大家说明这个问题，希望对大家的科研有所帮助噢！

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称，其中最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。双荧光素酶报告基因检测实验通常以萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）为报告基因，以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为内参基因，双荧光素酶报告基因检测实验具有检测灵敏度高、检测范围广、检测方便的优势，且在植物、动物体内无报告基因内源性表达，使得双荧光素酶报告基因检测实验广泛应用于miRNA靶基因验证、转录因子调控验证、启动子分析等多种研究。

发光机制：

萤火虫荧光素酶催化的发光反应原理为在ATP、Mg²⁺和O₂存在的条件下，虫荧光素在虫荧光素酶的催化下氧化发光，发光颜色为黄绿色。

海肾荧光素酶催化的发光反应原理为在O₂存在的条件下，腔肠素氧化产生高能量的中间产物，发光颜色为蓝色。

图1 荧光素酶发光原理(赵斯斯，2012)。（A）萤火虫荧光素酶催化反应原理；（B）海肾荧光素酶催化反应原理。

利用发光机制把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒，然后转染植物或者动物细胞，经适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

见“天呐！这个实验系统也太强大了吧！”

miRNA可以通过基因剪切或翻译抑制等方式来调控靶基因，精准控制其表达水平。目前的研究表明，miRNA可通过3种机制介导基因沉默：一是miRNA对靶mRNA的直接剪切；二是miRNA结合靶mRNA，抑制编码基因的翻译；三是在转录水平的另一种调控方式，即miRNA靶向靶DNA，在转录水平沉默基因的表达。与miRNAs结合的mRNA的命运取决于miRNAs与它的目标物mRNA之间的互补程度。通过将预测能够与miRNA结合的靶基因序列（5’UTR、3’UTR、ORF区域）插入LUC的报告基因载体上，当miRNA和质粒中的插入序列结合后，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终使荧光值降低。

图2 我司验证miRNA与mRNA靶向互作时的载体构建原理图。

双荧光素酶报告基因检测实验验证microRNA同mRNA靶向互作时可按照如下组合进行测定（以靶序列在3’UTR为例进行说明）：

对照组：miRNA对照组（miRNA-NC）和3’UTR野生型（3’UTR-WT）；

实验组：miRNA过表达（miRNA）和3’UTR野生型（3’UTR-WT）；

可根据实验需要设置突变组：

miRNA对照组（miRNA-NC）和3’UTR突变型（3’UTR-Mut）；

miRNA过表达（miRNA）和3’UTR突变型（3’UTR-Mut）。

注：3’UTR野生型是指靶基因3’UTR片段（以结合位点为中心，含上下游各200bp，若靶序列不在3’UTR区域，而在ORF区域，那么对应的野生型就是结合位点的短序列，不包含上下游200bp的序列）；3’UTR突变型是指靶基因3’UTR结合位点突变后的片段。

注意在植物中需要多预测靶点结合的位置，根据需求插入对应的区域（5’UTR、3’UTR、ORF区域）至LUC的报告基因载体上，而不仅仅只有3’UTR区域。

图3 我司瞬时表达载体pGreen II 0800-miRNA的载体图谱。

LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控中起着重要作用。许多lncRNA具有与mRNA相似的结构，因此miRNA可通过与作用于mRNA类似的机制对lncRNA起负调控作用，将候选的lncRNA序列插入报告基因载体上，检测萤光素活性。

图4 我司验证miRNA与lncRNA靶向互作时的载体构建原理图。

启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，本身并不转录，通过结合、活化RNA聚合酶，发挥转录起始的作用。双荧光素酶报告基因检测实验是检测启动子活性的重要手段。预测启动子序列，一般取转录起始位点（ATG）上游2000bp作为可能的启动子，将预测得到的序列构建至萤火虫荧光素酶报告基因的上游，通过报告基因判断启动子活性。

双荧光素酶报告基因检测实验验证启动子活性时可按照如下组合进行测定：

对照组：pGreenⅡ0800-LUC空载质粒转化植物细胞；

实验组：pGreenⅡ0800-pro-LUC重组质粒转化植物细胞。

将待测启动子区域序列（通常2000bp左右）进行分段截短（截短原则一般是通过预测的顺式作用元件所在的位置进行截短），或对特定位点进行突变，再分别插入LUC报告基因上游，检测其启动子活性。

图5 我司分析启动子结构时的载体构建原理图。

双荧光素酶报告基因检测实验验证启动子活性时可按照如下组合进行测定：

对照组：pGreenⅡ0800-LUC空载质粒转化植物细胞；

实验组：pGreenⅡ0800-LUC启动子不同片段长度重组质粒转化植物细胞。

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记。启动子区的SNP发生变化，就会导致与调控因子的结合能力发生改变，从而影响正常的基因表达。一些基因的启动子区域存在SNP，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性，构建包含SNP的启动子报告系统，检测其启动子活性。

图6 我司进行启动子SNP分析时的载体构建原理图。

双荧光素酶报告基因检测实验进行启动子SNP分析时可按照如下组合进行测定：

对照组：pGreenⅡ0800-LUC空载质粒转化植物细胞；

转录因子（Transcription factor，TF）也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。以GAL-TATA结合元件的35S启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，将转录因子构建至GAL4 DNA-BD载体上作为效应基因，把效应基因载体和报告基因载体共转化细胞或组织，然后通过报告基因表达水平来检测转录因子活性。

图7 我司验证转录因子转录活性时的载体构建原理图。

文献案例：

2023年3月2日，Li等人在Frontiers in Plant Science上发表了题为“Overexpression of the cotton trihelix transcription factor GhGT23 in Arabidopsis mediates salt and drought stress tolerance by binding to GT and MYB promoter elements in stress-related genes”的研究论文，该研究在拟南芥原生质体中进行双荧光素酶报告基因测定发现GhGT23:GAL4DBD没有激活荧光素酶表达，表明GhGT23是一种可能缺乏转录激活活性的转录因子。

图8用双荧光素酶报告基因测定GhGT23的转录活性(Li et al., 2023)。（A）双荧光素酶报告基因实验中用于检测GhGT23转录活性的报告子和效应子载体构建图。（B）双荧光素酶实验检测GhGT23的转录活性。

本研究中双荧光素酶报告基因检测实验验证启动子活性是按照如下组合进行测定的：

阳性对照：GAL4DBD-VP16和GAL4报告载体共转化原生质体；

阴性对照：GAL4DBD和GAL4报告载体共转化原生质体；

实验组：GAL4DBD-GhGT23和GAL4报告载体共转化原生质体。

植物生长和发育由多种转录因子控制，转录因子仅与其靶启动子中的特异序列（顺式作用元件）共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。双荧光素酶报告基因检测实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异序列结合的重要手段，将启动子区域序列插入报告基因载体，同时共转入转录因子，可分析转录因子是否提高萤光素酶活性。

图9 我司验证特定转录因子与其靶启动子特异序列结合时的载体构建原理图。

文献案例：

2023年2月23日，Zou等人在Plant Physiology上发表了题为“Transcription factor LcNAC002 coregulates chlorophyll degradation and anthocyanin biosynthesis in litchi”的研究论文，该研究利用双荧光素酶报告基因检测实验、酵母单杂实验和EMSA实验共同证明LcNAC002可直接结合到LcSGR和LcMYB1的启动子上并增强它们的表达。

图10 LcSGR和LcMYB1是LcNAC002的下游靶基因(Zou et al., 2023)。（A）双荧光素酶报告基因检测实验表明LcNAC002激活LcSGR和LcMYB1的启动子。（B）酵母单杂交实验表明LcNAC002与LcSGR和LcMYB的启动子结合。（C）EMSA实验表明LcNAC002与LcSGR和LcMYB启动子结合。（D）GST-LcNAC002（0~150aa）重组蛋白分别与LcSGR和LcMYB1启动子的430-460和1772-1802上游片段结合。

本研究中双荧光素酶报告基因检测实验验证特定转录因子与其调控的启动子之间的作用是按照如下组合进行测定的：

图11 瞬时表达载体pGreen II 62-SK的载体图谱(Hellens et al., 2005)。

图12 瞬时表达载体pGreenII 0800-LUC的T-DNA区域(Hellens et al., 2005)。

双荧光素酶报告基因检测实验在以上七个方面的应用技术服务我司均可以提供，如果各位小伙伴们有相关的研究需求，可随时联系我们喔！

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