写在前面

今天推荐的是由南开大学药用化学生物学国家重点实验室团队在2019年1月1日发表于Theranostics（IF：8.393，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Cheng Yang教授，研究表明USP5通过稳定肝细胞癌的SLUG促进上皮-间质转化。

研究背景

肝细胞癌是最常见的恶性肝脏肿瘤，上皮-间质转化（EMT）在肿瘤的进展中起着关键作用。肿瘤细胞经过EMT后会转变为具有侵袭能力的间质表型，从而增加迁移能力。因此，抑制EMT是抑制肿瘤转移的一个重要途径。SLUG是一个锌指转录因子，在EMT进展中通过E-cadherin近端启动子的E-box元素抑制E-cadherin的转录。SLUG在肿瘤进展过程中的上皮-间质转化中的作用已被彻底研究，但其精确的调控仍未被充分探索。

摘要部分

作者通过亲和纯化、质谱分析和CO-IP来确定SLUG与泛素特异性蛋白酶5（USP5）之间的相互作用。去泛素化试验证实了USP5对SLUG去泛素的影响。采用双荧光素酶报告法和染色质免疫沉淀法来观察USP5对SLUG的直接转录调节。通过Western blotting和免疫荧光检测EMT相关标志物。检测了分子对接、SPR传感器（biacore）和共定位，以证明芒柄花素针对USP5。通过生物信息学分析，研究了USP5和SLUG与HCC恶性程度的关系。在HCC细胞中进行细胞迁移、侵袭和裸鼠异种移植模型，以检测USP5的促进作用和芒柄花素对EMT的抑制作用。结果发现。USP5与SLUG相互作用并稳定SLUG，通过USP5的去泛素化活动在肝细胞癌（HCC）的上皮-间质转化（EMT）中调节其丰度。在恶性程度高的HCC中，USP5高度表达并与SLUG的表达呈正相关。敲除USP5可抑制SLUG的去泛素化，抑制HCC细胞的增殖、转移和侵袭，而过量表达USP5可促进SLUG的稳定性和体外及体内的EMT。通过虚拟筛选，作者发现芒柄花素与USP5有良好的结合。此外，芒柄花素抑制了USP5对SLUG的去泛素化活性，从而阻碍了HCC的EMT和恶性进展。

研究内容

1.SLUG与USP5有相互作用

为了全面了解SLUG的功能，作者进行了亲和纯化和质谱分析以确定SLUG的相互作用蛋白。USP5，一种去泛素化酶，被发现在含有SLUG的蛋白复合物中。为了探索SLUG和USP5之间的关系，在Hela细胞提取物中进行了共同免疫沉淀实验，结果显示SLUG与USP5有效地共同免疫沉淀。同时，USP5也与SLUG有效地共免疫沉淀。

为了进一步确认SLUG和USP5之间的相互作用，作者进行快速蛋白液相色谱（FPLC）实验。结果表明，来自Hela细胞的原生SLUG被洗脱，其表观分子质量远远大于单体蛋白的质量。大部分SLUG与USP5共存于一个多蛋白复合物中。对TCGA数据库中USP5和SLUG表达的相关性分析显示，USP5和SLUG的表达水平与GEPIA数据库中的TCGA HCC样本呈正相关。

另一方方面，根据PLC-PRF-5和Hep3B细胞的免疫荧光实验或N-STORM用针对SLUG和USP5的抗体进行免疫染色，准确分析了这两种蛋白的共定位。

图1.SLUG与USP5有相互作用

研究结论：SLUG与USP5存在物理相互作用和空间共定位。

2.USP5通过其去泛素化功能稳定SLUG

为了解USP5和SLUG之间的物理相互作用和空间共定位的功能意义，PLC-PRF-5和Hep3B细胞敲除或过量表达了USP5和SLUG。敲除USP5会降低SLUG的表达，而敲除SLUG时USP5的表达几乎没有变化，且SLUG蛋白水平的降低可以被蛋白酶体抑制剂MG132所回补。

作者认为USP5通过蛋白酶体抑制SLUG的降解来稳定SLUG。为了证实这一点，作者进行了环己酮（CHX）追逐试验，以检测USP5敲除或过表达处理下SLUG的半衰期。结果显示，在USP5缺陷的细胞中，SLUG的半衰期缩短。一致的是，USP5的过度表达延长了SLUG的半衰期。

考虑到USP5作为DUB的功能，作者推测USP5可能通过去泛素化SLUG来影响SLUG的稳定性。去泛素化实验证实，在USP5过量表达的细胞中，SLUG蛋白上的泛素明显减少，而当USP5被敲除时，泛素相应增加。

图2.USP5通过其去泛素化活性稳定SLUG

研究结论：USP5通过去泛素化SLUG促进SLUG的稳定。

3.USP5促进肝细胞癌的EMT和转移

SLUG是EMT中的一个关键蛋白，通过抑制E-cadherin的表达促进EMT的进展。为了了解USP5介导的稳定SLUG的生物学意义，作者研究了USP5对EMT的影响。ChIPBASE图案分析显示了SLUG的结合基序。染色质IP（ChIP）检测显示，SLUG与E-cadherin启动子的结合在USP5缺陷的细胞中被明显抑制。荧光素酶报告基因检测显示，敲除USP5干扰了SLUG对E-cadherin的转录抑制，而过度表达USP5则相反。Western blot分析进一步证实，在敲除USP5的PLC-PRF-5和Hep3B细胞中，上皮标志物（E-cadherin、cytokeratin和occludin）的表达水平增加，间质标志物（Vimentin、N-cadherin和myosin）的表达水平下降，而过度表达USP5，EMT相关标志物有相应变化。敲除USP5增加了E-cadherin的荧光强度，但减少了Vimentin的荧光强度，而在USP5过表达的细胞中，其结果正好相反。

为了确定USP5/SLUG在HCC体内恶性进展中的作用，将USP5缺陷或过表达的PLC-PRF-5和Hep3B细胞皮下移植到裸鼠体内，建立异种移植模型。肿瘤的生长在接受肿瘤移植的裸体小鼠中被抑制，而在接受肿瘤移植的小鼠中，USP5过度表达的肿瘤生长被促进。敲除USP5组的肿瘤重量减少，而USP5过表达组的肿瘤重量增加。最后，作者用免疫组织化学（IHC）染色法检查了异种移植中USP5、SLUG、E-cadherin、Vimentin和Ki67的表达水平。

图3.USP5促进肝细胞癌的EMT

研究结论：USP5促进了肝细胞癌的生长和转移。

4.USP5和SLUG的表达水平与肝细胞癌的恶性程度有关

作者接下来对临床数据进行分析以证实USP5/SLUG轴在HCC中的作用。通过对人类蛋白质图谱的免疫组化检测的代表图像和评分发现，USP5和SLUG在肿瘤中的表达高于正常肝组织。UALCAN数据库对TCGA样本的癌症转录分析也显示，与正常肝组织相比，USP5和SLUG在肝细胞癌组织中的表达很高。同时，USP5和SLUG的表达与TCGA肝细胞癌样本的临床分期和病理分级呈正相关。生存分析也显示，USP5和SLUG的高表达表明预后不佳。USP5与关键转录因子和EMT相关标志物（TWIST1、Vimentin、MMP2、MMP9和N-cadherin）的相关性分析显示，USP5的表达与EMT和肿瘤转移密切相关。

图4.USP5和SLUG的表达与肝细胞癌恶性程度有关

研究结论：SP5/SLUG轴促进了HCC患者的恶性进展，因此支持将USP5/SLUG作为HCC治疗的潜在目标。

5.芒柄花素以USP5为靶点抑制SLUG的去泛素化

作者通过分子动力学模拟显示芒柄花素在100ns内A5B与USP5结合的动态变化。分子对接结果显示，在USP家族成员中，芒柄花素对USP5的结合达到了最高的性能。同时作者研究发现，芒柄花素-探针、USP5和SLUG相互之间是共定位方法。为了进一步验证USP5是否与芒柄花素作用，作者进行了Biacore实验。解离常数（Kd值）为25.1 μM。所有的结果证明，芒柄花素针对USP5 。

为了探讨芒柄花素对USP5/SLUG轴的影响，用不同浓度的芒柄花素处理的-PRF-5细胞进行WB分析。结果证明，SLUG的表达水平下降。作者还进行了泛素化实验，检测芒柄花素处理的PLC-PRF-5细胞中SLUG的泛素，结果表明在芒柄花素处理组，SLUG的泛素增加。

图5.芒柄花素以USP5为目标，抑制SLUG去泛素化

研究结论：芒柄花素以USP5为目标，抑制SLUG的去泛素化。

6.芒柄花素抑制肝细胞癌的EMT

为了研究芒柄花素对抑制USP5的影响，在用不同浓度的芒柄花素处理的细胞中进行了ChIP检测。结果显示，芒柄花素处理抑制了SLUG与E-cadherin启动子的结合。荧光素酶报告基因检测显示，芒柄花素以剂量依赖的方式增加E-cadherin的转录活性。扫描电子显微镜（SEM）检测显示，芒柄花素处理刺激了细胞表型从间质表型转变为上皮表型。这一结果也得到了Western blot分析的支持。

western blot分析进一步显示，芒柄花素处理提高了PLC-PRF-5和Hep3B细胞中上皮标志物的表达水平，降低了间质标志物的表达水平。此外，PLC-PRF-5和Hep3B细胞的集落形成、Transwell和伤口愈合试验显示，芒柄花素抑制了HCC细胞的集落形成、迁移和入侵。

图6.芒柄花素可抑制肝细胞癌的EMT

研究结论：芒柄花素抑制肝细胞癌的EMT。

结论与讨论

总之，作者首次揭示了USP5与SLUG的物理相互作用，并通过其去泛素化活性稳定SLUG。芒柄花素通过抑制USP5对HCC中SLUG的去泛素化作用，显示出良好的抗肿瘤活性。进行结构修饰以获得性能更好的化合物对开发针对USP5/SLUG的临床抗肿瘤药物具有重要意义。

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原文链接：https://www.thno.org/v09p0573.htm