mRNA 从首次被发现到首个疫苗获批上市经历了近 60 年的发展。目前，mRNA 技术已经从疫苗扩展到抗体、蛋白替代疗法，应用场景也从传染病拓展至肿瘤、代谢性疾病、罕见病等。
不过，mRNA 分子也存在不稳定、易降解、体内翻译效率不高等问题，需要进行加帽、加尾、对 mRNA 天然碱基进行修饰和替换等方式优化。
近日，港科大旷怡（Becki Yi KUANG）团队通过优化 mRNA 的 poly(A)尾巴序列显著提高了合成蛋白质的效率和表达量。在研究中，科研团队在 mRNA 的尾巴附近用胞嘧啶 C 替换了一部分腺嘌呤 A（C substitutions 或 C-containing tails），即通过特异性干预天然降解机制减缓了 mRNA 在体内的降解速率，增加了 mRNA 在体内的表达性能和表达时间。
（来源：Molecular Therapy Nucleic Acids）
研究发现，这种 C 替换 A 方式与其位置和数量占比存在一定的关系，当在 mRNA 尾巴序列附近多个 C 替换 A 时，显著提高了 mRNA 的蛋白质生产率并延长蛋白质表达时间。进一步讲，在尾部附近 C 替换 A 的占比约为 20% 时，这种优化方式对合成蛋白质效率和表达量的增强效果最佳。
研究人员指出，细胞和小鼠试验结果显示，尾巴 C 替换 A 序列的方式可将蛋白质表达提高 3-10 倍。这种高效表达蛋白质的新方式可以减少 mRNA 药物和疫苗所需的注射量和次数，有望降低治疗成本。还也可以与其他 mRNA 修饰方法联合使用，达到 1+1>2 的效果，有潜力广泛应用于临床研究中。
（来源：上述论文）
本研究的通讯作者是旷怡博士，她现在是港科大化学与生物工程系助理教授。旷怡本科毕业于中山大学，博士毕业于美国布兰迪斯大学化学系，还曾在京都大学干细胞研究所从事 mRNA 和干细胞研究工作。她实验室的研究方向是合成生物学、生物材料，尤其是开发多种优化 mRNA 的方式并将其作为工具应用于生物和医疗健康领域，包括修饰核苷酸、UTR 优化、mRNA 感应开关等。
旷怡告诉生辉，这项研究更科学地阐释了 mRNA 尾巴修饰机制对蛋白质表达的影响，也为系统探索合成 mRNA 的尾部序列优化提供了新范式。
系统阐释尾部序列优化 C 替换 A 机制，位置和频率影响蛋白表达量
由于大多数真核生物的 mRNA 3'末端都包含由 100-200 个 A 组成的 Poly（A）尾巴，传统上认为 mRNA 的 Poly（A）尾巴是由腺苷链。不过，近十几年来，越来越多的研究指出，天然 mRNA 尾部会混合单个或多个非腺苷核苷酸，包括 C/G/U。对于这一现象涉及的具体机制更是鲜有系统性的研究和报道。
“从现象出发，我们人工合成了 mRNA，并从 2019 年起，分别探究了 C/G/U 序列在不同位置和不同数量等情况下对 mRNA 合成蛋白质的影响，并对尾巴序列机制做了系统研究。”旷怡说。
（来源：受访者提供）
在试验中，研究团队为了检测尾巴位置中非 A 核苷酸对 mRNA 合成蛋白质的影响，首先合成了一系列 EGFP mRNA，这些合成的 mRNA 尾巴包含 40-nt 序列且混合不同单个核苷酸，包含 40 个 A 序列的尾巴为参照尾巴（40A）。
通过转染和流式细胞分析，研究人员发现，EGFP-39AUmRNA 在转染 4、24、48 和 72 小时后蛋白质表达量最低，这与之前的研究结果尾部 U 替代 A 有利于 mRNA 降解的结论一致。而 EGFP-38ACA mRNA 在所有时间点内表达的 EGFP 蛋白最多，且转染导致的细胞活力降低不显著。
研究人员还观察到尾巴尾部含有 G 序列可能在转染过程中触发先天免疫反应，导致蛋白质生产较低。而包含 C 序列尾巴增强蛋白质表达与转染无关，且不会触发先天免疫反应，这表明含 C 序列的尾巴能提高合成 mRNA 的性能。含 C 的尾巴可以保护 mRNA 免受 CNOT 复合物诱导的脱腺苷酸化（也称“poly(A)尾巴降解”），从而延长 mRNA 在细胞内的半衰期，促进蛋白质产生。
▲图｜尾巴核苷酸替换对 mRNA 翻译成蛋白质的影响（来源：上述论文）
为进一步确认 C 替换 A 对合成蛋白质的影响，研究团队构建了尾巴包含两个 C 的 EGFP mRNA。与尾巴为 40A 或 38ACA 的 mRNA 相比，尾巴附近（near the end of the tail ）包含相邻或分开双 C 替换 A 的 mRNA 表达的 EGFP 蛋白量更高。而尾巴末端（at the end of the tail）的双 C 替换只能诱导蛋白质产量微量增强。
当在一些 mRNA 远离 3' 端的不同位置放入单个 C，这些 mRNA 在细胞中诱导蛋白质 EGFP 表达量低于 EGFP-40A。这进一步验证只有尾部附近的 C 替换 A 才能增强蛋白质表达。
▲图｜胞苷在尾部的位置和频率对 mRNA 翻译的影响（来源：上述论文）
接下来，研究团队重点研究了尾部附近的 C 替换 A 的效果。首先，他们在源自不同人体组织的细胞系、干细胞及其分化细胞等 8 种不同类型细胞上进行了验证。研究发现，在所测试的所有细胞系中，尽管蛋白表达水平略有差异，但尾部附近的 C 替换 A 可以诱导合成 mRNA 的蛋白质表达增强，也进一步表明这种尾巴序列修饰可广泛应用不同的细胞类型中。
然后，研究团队设计了尾巴包含 40-nt 序列且尾部附近包含不同数量 C 的 EGFP mRNA 探究了 C 的频率与蛋白质表达增强之间的关系。数据显示，所有尾巴尾部附近包含 C 的 mRNA 表达的蛋白量明显高于 EGFP-40A。然后在包含 60-nt 和 100-nt 序列尾巴的 mRNA 中进行了重复验证，研究团队发现在尾部附近大约 20% 左右的 C 替换 A 时，蛋白质表达增强的效果最佳。
进一步的研究表明，C 替换 A 的连续性也是促进蛋白质表达增强的重要因素。
提升 mRNA 工具性能，可将蛋白质表达增加 3-10 倍
在研究中，试验团队评估了含有 C 序列的尾巴对 mRNA 合成工具的影响，这往往作为调控细胞特异性蛋白质表达的工具。
研究团队开发了两种模式 mRNA 工具，一种是感应 MS2 蛋白的蛋白质响应 mRNA 开关即 MS2CP 开关，另一种是感应 miR-21-5p 的 microRNA 响应 mRNA 开关即 miR-21-5p 开关。试验中的这两种开关都会抑制蛋白质的表达，EGFP ORF 作为两个开关中的报告基因。
数据显示，相比之下，MS2CP 开关和 miR-21-5p 开关表现出了更强的灵敏性。论文中指出，这些数据进一步表明含 C 的尾巴通常对合成 mRNA 工具的性能具有显著的积极影响。
接下来，研究团队构建了 FLAG 标记编码卵清蛋白的 mRNA（OVA mRNA），这是一种常用的模式 mRNA 疫苗，并评估了含有 C 序列尾巴的 mRNA 对抗原表达的影响。
通过免疫印迹法和流式细胞分析 OVA-100A 和 OVA-79A20CA 在细胞中卵清蛋白的表达量，这两种方式指出 OVA-79A20CA 产生的卵清蛋白更多，提示含有 C 序列的尾巴可以提升 mRNA 疫苗的抗原表达量。
▲图｜尾部 C 替换取代增强了模型合成 mRNA 的性能（来源：上述论文）
然后，该团队评估了一种含有 C 序列尾巴对 mRNA 编码的功能性酶-碱性磷酸酶 (SEAP) 和 mRNA 编码萤火虫荧光素酶的影响，试验进一步验证了尾巴附近 C 替换 A 可增加蛋白质表达，且延长了 mRNA 合成蛋白质的生产过程。
同时，还利用脂质聚合物将包含 40A 或 31A8CA 尾巴的 Luc mRNA 疫苗注射到小鼠体内，数据与 SEAP 一致，含 C 序列尾巴的 mRNA 可延长蛋白生产窗口和总蛋白生产的持续时间。
旷怡总结道，整体来看，无论是在细胞体内还是小鼠体内，尾巴序列修饰可增加大约 3-10 倍蛋白质表达量。其中，荧光蛋白表达接近 2 倍多，在小鼠体内注射模式 mRNA 疫苗的蛋白质表达量增加了约为 6 倍，磷酸酶的表达量在第一天就已经超过了 10 倍。
研究团队还评估了尾部序列优化对 mRNA 在体内半衰期的影响，数据表明含 C 序列的尾巴可以延长 mRNA 在细胞内的半衰期。
联合使用效果更佳，已申请相关专利
论文中提到，含 C 序列的尾巴可以保护 mRNA 免受 CNOT 复合物诱导的脱腺苷酸化，CNOT 途径是一种天然降解机制，可延缓 mRNA 降解速度。这提示这种尾巴序列优化具有一定的安全性和有效性。
另一方面，这种尾巴序列优化独立于其他 mRNA 优化技术路径之外，可以与这些优化手段联合使用。
在试验中，研究小组已经验证将帽修饰与尾巴序列修饰联用，可以实现协同效应，并达到蛋白质表达增强最佳的效果。旷怡告诉生辉，mRNA 尾巴序列优化方式已经申请了相关专利。
（来源：受访者提供）
“尾巴序列优化这种方式操作很简单，只需改变一个序列，其他合成 mRNA 的步骤不需要发生变化，也无需对操作人员进行专业培训。”旷怡说。
旷怡还指出，在试验中已经从细胞类型、核酸转染剂等多个角度验证了这项技术应用的通用性和广泛性。
接下来，研究团队将会继续与中山大学夏小俊课题组合作推进尾巴序列优化 mRNA 疫苗的小鼠试验，完善动物试验，进一步验证 mRNA 癌症疫苗的可行性。
该研究团队也有计划推进这项技术的转化工作。“这项新技术不仅可以减 mRNA 药物和疫苗所需的注射量和次数，而且还有可能降低治疗成本，具有广泛的临床应用价值。我们期待和生产 mRNA 药物的药厂合作，把这项技术应用于其 mRNA 疫苗和相关药物的开发中。”旷怡说。
