点评 | 董晨（中国科学院院士）、田志刚（中国工程院院士）

CD8+T细胞耗竭是机体免疫系统不能有效清除慢性病毒感染及恶性肿瘤的关键原因。相较于急性感染或者疫苗免疫情形下诱导形成的记忆性CD8+T细胞， 耗竭的CD8+T细胞表面持续表达包括PD-1在内的免疫检查点分子，其增殖潜力、效应及杀伤功能等都较为低下，且易于凋亡。耗竭T细胞在领域内也一度被称为“僵尸” (Zombie) 细胞。

通过单克隆抗体阻断PD-1介导的抑制性信号，可以在一定程度上逆转CD8+ T细胞耗竭，促进病毒清除或控制肿瘤进展，构成了PD-1免疫检查点阻断疗法（Immune checkpoint blockade, ICB）临床应用的基础。目前，尽管该疗法在系列癌症治疗中取得了较好的效果，但仍然面临很大的挑战：首先，一些恶性程度较高的癌肿，如胰腺癌、脑胶质瘤、三阴性乳腺癌等，几乎不响应ICB；即使在响应的肿瘤类型里，病人的总体响应率较低（约20%-30%）；并且，在开始响应的病人里，治疗后期大多会出现耐药抵抗，只有极少数病人可长期获益并临床治愈。尽管如此，相比于靶向其它免疫检查点分子或抑制性信号，PD-1 ICB仍显现出最优疗效。可以预测，在目前及未来一段时间， PD-1 ICB仍将是肿瘤免疫治疗的重要基石，而进一步提升PD-1 ICB的响应人群及临床治愈潜力则在很大程度上将依赖于对PD-1 ICB作用机制的更深入理解。

叶丽林团队及Rafi Ahmed，Di Yu等研究团队在2016年分别独立发现, 慢性病毒感染中，位于淋巴组织内的耗竭程度较低的CXCR5+TCF-1+ Tim3-CD8+T细胞作为耗竭前体细胞（progenitor exhausted T cell, Tpex），功能性响应PD-1 ICB【1-4】。Tpex的发现打破了将耗竭T细胞作为“Zombie”细胞的固有印象，并立即成为T细胞耗竭领域的研究热点，目前相关论文已超过1500篇。多项研究在实体瘤中也发现TCF-1+Tim3- CD8+ T细胞对PD-1 ICB应答的关键作用【5-8】。后续更多的临床相关研究表明：此细胞亚群与PD-1 ICB疗效相关。基于这些研究，领域内的普遍观点认为，位于肿瘤组织微环境（TME）内的Tpex细胞直接介导了PD-1 ICB的抗肿瘤效应，但是此观点缺乏直接的实验性证据。并且，一个不可忽视的事实是，Tpex在TME的数目极低 （频率仅约5%）。另外，新的研究表明，响应PD-1免疫检查点治疗的细胞来源于肿瘤组织外部新补充的CD8+ T细胞克隆【9】，其可能来自于PD-1 ICB作用后的系统性的，而不是TME局部性的CD8+T细胞应答【10-12】。厘清这些领域内的关键性分歧对深入理解恶性肿瘤情形下的PD-1 ICB作用机制具有重要意义。

2022年10月7日，陆军军医大学全军免疫学研究所叶丽林团队与合作者中山大学中山医学院唐忠辉团队及南京大学鼓楼医院孙倍成团队在Cell杂志发表了文章The primordial differentiation of tumor specific memory CD8+ T cells as bona fide responders to PD-1/PD-L1 blockade in draining lymph nodes。该研究首次发现在肿瘤引流淋巴结中存在肿瘤抗原特异性的记忆CD8+T细胞，并证实了该群细胞在PD-1 ICB治疗中的关键作用。

利用多种移植瘤及原位肿瘤诱导模型，他们首先检测了引流淋巴结内的肿瘤特异性CD8+ T细胞，发现一定比例细胞高表达TCF-1，低表达PD-1, 但不表达耗竭特异性的转录因子TOX。重要的是，该细胞群（TOX-PD-1loTCF-1+）严格符合经典免疫记忆特征：1.不依赖于抗原的长期存活；2. 再次遇到抗原，迅速大幅扩增，并分化为功能性的效应细胞；3. 提供长期的免疫保护。基于典型的记忆性特征和特殊组织定位，他们将其命名为肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆CD8+ T细胞，即TdLN-TTSM(Tumor Draining Lymph Node derived Tumor Specific Memory T cell)。

随后通过高通量测序分析，研究人员发现在单细胞层面，TdLN-TTSM细胞转录特征更接近经典记忆细胞，而与耗竭T细胞差异较大。进一步分析ATAC-seq数据分析也得到一致的结论。通过PCA分析可以看到，淋巴结来源的抗原特异性CD8+ T细胞表观遗传修饰特征从应答第4天就已经建立， 并与Tmem有很大程度的相似，但二者也具有各自特征性的染色质开放区域（图2）。另外，CD8+T细胞在进入耗竭状态后，其基因组会在耗竭相关分子区域的表观遗传层面发生一些不可逆的改变，称为表观遗传伤疤（epigenetic scarings）【13-15】。通过分析TdLN-TTSM, TdLN-Tpex的ATAC-seq测序数据，发现肿瘤引流淋巴结及慢性病毒感染来源的Tpex细胞以及脱离慢性病毒感染环境的Tex细胞（Recovery Tex）均在Pdcd1、Tox等基因多个位点存在不同程度的染色质开放，然而这些位点在TdLN-TTSM细胞中处于关闭状态， 进一步证明这一特定细胞亚群不是耗竭T细胞。

与该群细胞的记忆特性相一致，向荷瘤小鼠分别回输来源于肿瘤和引流淋巴结的抗原特异性CD8+ T细胞， TdLN-TTSM细胞呈现出显著优于Tpex及Tex的抑制肿瘤能力。

进一步，在体内和体外实验中，TdLN-TTSM细胞在应对PD-1抗体处理时比TdLN-Tpex细胞表现出更强的应答表现。并且，通过一系列肿瘤移植实验和淋巴结切除实验，发现PD-1/PD-L1 ICB处理后，肿瘤组织内扩增的抗原特异性CD8+ T细胞主要来源于TdLN-TTSM，而不是肿瘤中已经浸润的、耗竭的Tex及Tpex细胞。并且，无论在 PD-1/PD-L1 ICB治疗前或治疗中，去除此细胞亚群均导致PD-L1阻断抗体介导的免疫治疗失效；而回输TdLN-TTSM细胞则可以恢复此作用，进一步验证了TdLN-TTSM是真正响应PD1 ICB的细胞亚群。

总结这项研究，其创新性及对将来肿瘤免疫治疗研发的提示作用主要体现在以下几个方面：1. 打破了在肿瘤负荷下，只存在耗竭T细胞，不存在肿瘤特异性记忆T细胞的传统概念；2.进一步完善了PD-1 ICB的时空作用机制：即PD-1 ICB先在引流淋巴结扩增、动员TdLN-TTSM细胞分化为耗竭前体细胞，再进入TME发挥作用，不同类型及状态的TME可能决定这些PD-1 ICB动员过来的细胞发挥抗肿瘤作用的潜力（下图）。这一结论也提示，PD-1 ICB与靶向TME的调节因子向结合，可能导致更好的协同抗肿瘤作用；3.对于需清扫淋巴结的肿瘤外科手术而言，清扫时可考虑从这些淋巴结中分选、扩增TTSM细胞，过继转输回术后病人，辅以免疫检查点治疗，可能会防止肿瘤术后复发或者转移；4. TdLN-TTSM细胞是相对于处于耗竭状态的TIL更优的抗肿瘤过继T细胞疗法。

该研究由陆军军医大学全军免疫学研究所叶丽林教授、许力凡副教授，中山大学中山医学院唐忠辉教授及南京大学鼓楼医院孙倍成教授共同合作完成。第一作者为南方医科大学广东省免疫治疗与免疫调节重点实验室黄启钊副研究员、中山大学中山医学院吴霞研究员、陆军军医大学全军免疫学研究所王志明博士及南方医科大学博士生陈香宇。

叶丽林团队聚焦针对病毒感染及恶性肿瘤的T细胞应答的基础与转化研究，相关论著发表于Nature (2016), Cell (2022), Nature Immunology (2015, 2021), Nature Medicine (2018), Immunity (2017)及Cell Host&Microbe (2022)等。现拟招收肿瘤免疫研究方向的Co-PI及博士后，工作地点可选择重庆及北京（昌平国家实验室）。

专家点评

董晨（清华大学免疫学研究所，中国科学院院士）

CD8+T细胞直接杀伤病毒感染或者癌变的靶细胞，在抗病毒感染及抑制肿瘤发生、发展中发挥关键作用。在急性病毒感染（如流感病毒感染或致弱病毒疫苗接种）情形下，初始（Nave）病毒抗原特异性的CD8+T细胞在二级淋巴组织（脾脏或者淋巴结）通过其T细胞受体（TCR）识别树突状细胞表面的MHC-病毒抗原短肽复合物，在共刺激分子的作用下，得以激活及扩增，并进一步分化为效应性CD8+T细胞（Effector T cells, TEF），这些效应细胞迁移到感染的外周组织，清除病毒抗原。随后，超过90%的效应T细胞会死于凋亡，但是约5-10%效应T细胞，又称为记忆性前体细胞（precursors of memory T cells, TMP），具有存活优势，其生存下来，并进一步分化为不同的记忆性T细胞亚类，包括位于淋巴组织的中央记忆细胞（central memory, TCM），在外周血液与组织之间循环的效应记忆细胞（effector memory, TEM）以及定居于外周组织的组织驻留记忆细胞（tissue resident memory, TRM）等，并通过抗原非依赖的方式静态增殖，长期、甚至终生维持。再次遇到相同的病毒感染时，这些不同亚群的记忆细胞可以快速、高效地清除病毒感染。

但是，在慢性病毒感染以及恶性肿瘤情形下，因为抑制性免疫微环境及持续的抗原刺激，激活后的CD8+T细胞通常被认为丧失分化为记忆细胞的潜力，它们只能先分化为耗竭程度较低的耗竭前体细胞（Progenitor of exhausted T cells, TPEX）(叶丽林团队在2016年的Nature论文同时共同发现并鉴定了TPEX细胞亚群)，并最终分化为终末耗竭T细胞（terminal exhausted T cells, TEX）。虽然慢性感染和肿瘤模型中的TPEX具有和记忆细胞类似的增殖和分化潜能，但是它们在转录组和表观组水平有很大的差异【16,17】。另外重要的是，在慢性感染进行到30天后，TPEX的记忆潜能受到很大损害，它再次遇到抗原时的增殖能力显著低于急性感染模型中的记忆细胞【18】，因此TPEX被认为并不是真正的记忆细胞。

但是，叶丽林及其合作者在最新上线的Cell论文中，应用小鼠肿瘤模型，发现在肿瘤引流淋巴结内，其实存在真实的记忆性CD8+T细胞，它们高表达TCF，但是不表达耗竭特异性的转录因子TOX，因此被命名为tumor draining lymph node derived tumor-specific memory T cells (TdLN-TTSM)。在2021年，Aviv Regev和Tyler Jacks团队也报道小鼠肿瘤引流淋巴结中持续稳定地存在一群表达TCF1的CD8+ T细胞，它们作为耗竭T细胞的“后备军”不断产生新的细胞进入肿瘤微环境【19】。这群新鉴定的TdLN-TTSM符合严格的关于记忆细胞的特征，比如高表达记忆细胞的特征分子（CD127, CD122和CD62L等），具有和记忆细胞更为相似的转录组和表观组的特征，同时低表达PD-1。重要的是，与引流淋巴结和肿瘤微环境中的TPEX相比，TTSM具有更强的、和记忆细胞相当的增殖潜能，能够产生更强大的抗肿瘤的能力。TdLN-TTSM位于TPEX细胞的分化上游，能够进一步分化成为TCF1+TOX+ TPEX细胞和TCF1-TOX+ TEX终末耗竭T细胞，并且能够有效迁移到肿瘤微环境中。更为重要的是，TdLN-TTSM是PD-1/PD-L1免疫检查点治疗的关键响应细胞，能够在治疗过程中持续响应PD-L1抗体的治疗。手术切除TdLN的小鼠则不再响应PD-1/PD-L1免疫检查点治疗。

除此之外，利用单细胞转录组和TCR测序技术，叶丽林及其合作者发现在肝细胞癌（HCC）患者的肿瘤引流淋巴结中同样存在TCF7+TOX- TdLN-TTSM。根据TCR克隆比对和虚拟时序分析，这群TdLN-TTSM表现出分化成为肿瘤浸润的TCF1+TOX+ TPEX细胞和TCF1-TOX+ TEX终末耗竭T细胞的发展轨迹，说明这一群细胞在癌症患者中可能也发挥着重要的抗肿瘤作用，但是它在临床免疫治疗中的作用仍需进一步地验证。

该项研究突破了领域对肿瘤特异CD8+T细胞亚群的认识以及对PD-1/PD-L1免疫疗法作用机制的理解。可以预见，像TPEX细胞亚群一样，TTSM在未来将成为肿瘤免疫研究领域的热点。因其典型的记忆性细胞特征，靶向TTSM细胞亚群可能会为肿瘤免疫治疗提供全新的策略和方案。

注：董晨教授团队孙勤利博士参与撰写了该点评。

专家点评

田志刚（中国科学技术大学，中国工程院院士）

靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的单克隆抗体已被批准用于临床，用于治疗系列恶性肿瘤。但是，该疗法依然存在系列挑战，例如，这些治疗性单抗对于一些癌肿几乎无效，在一些有效的癌肿，也只有少部分病人（约20%-30%）可以响应、并且大部分患者会出现适应性耐药等。在作用机制方面，PD-/PD-L单抗被广泛认为是在肿瘤微环境里，通过阻断PD-1信号通路所介导的“刹车”， 逆转T细胞耗竭，提升其杀肿瘤细胞功能，从而控制肿瘤进展。

叶丽林及其合作研究团队在最新上线的Cell论文对PD-1/PD-L1单克隆的抗肿瘤机制提供了新的见解。他们首先在转录、表观、表型及功能水平明确了位于引流淋巴结内的肿瘤特异性的TOX-TCF-1+CD8+T细胞是真实的（bona fide）记忆性T细胞， 简称TTSM。TTSM位于分化的最上游，持续补充位于肿瘤组织微环境中的各个耗竭T细胞亚类。因其典型的记忆特征，当这群细胞过继转输给荷瘤小鼠时，表现出远优于其它细胞亚类（包括耗竭前体细胞、TIL等）的肿瘤抑制效力。通过一系列淋巴结切除、肿瘤组织移植等实验，他们进一步发现，PD-L1抗体的抗肿瘤作用严格依赖于TTSM细胞亚群，其发挥抗肿瘤作用的前提是首先需要在引流淋巴结里扩增TTSM细胞亚群，并促进该细胞亚群分化为耗竭前体细胞，最终这些细胞的子代细胞进入肿瘤微环境，发挥抗肿瘤作用。这些发现进一步完善了PD-1/PD-L1免疫检查点阻断抗肿瘤的时空作用机制，具有较大的临床转化价值。特别是在肿瘤外科手术中同时清扫肿瘤相关各级淋巴结的病人，从这些淋巴结中分选、扩增TTSM细胞，过继转输回术后病人，辅以免疫检查点治疗，可能会防止肿瘤术后复发或者转移。另外，在基础研究方面，尽管在肝癌病人的肿瘤引流淋巴结中已鉴定TTSM细胞亚群，但是，在人的其它癌种中需要证实该亚群的存在，并且需要在PD-1/PD_L1治疗治疗响应及不响应的cohort中，证实该亚群的重要作用。

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