今天，小翌就带大家好好盘一盘这个克隆里的门道。

首先需要抽提质粒，质粒抽提的方法主要分为乙醇沉淀法和柱提法。质粒提取之后我们可以电泳检测抽提质粒的质量是否合格？抽提出来的质粒一般可以看到三条带：开环质粒、环状质粒和超螺旋质粒（如图1A）。除此之外，还可以采用紫外分光光度计对质粒进行检测，理论认为测出的质粒DNA的OD260/OD280若在1.6-1.8之间，较为纯净，若＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染，需要进一步纯化，以免影响后续酶切反应。

接下来就是载体的线性化，线性化载体的制备大致分为质粒酶切和反向PCR扩增两种，常用的方法为酶切制备线性化载体。良好的线性化载体条带是单一的，往往比超螺旋质粒的位置靠后（如图1A）。那么，如果遇见线性化载体电泳条带弥散（图1B）的情况，该如何处理呢？

若实验中线性化质粒出现多个条带或条带弥散（如图1B），首先需要考虑一下酶切时间是否过长从而导致出现了星星活性，或酶切体系中出现阻遏物。面对此类情况，首先我们要检查一下我们的酶切体系配置的是否合理，反应条件是否按照说明书进行。此处值得注意的是，质粒载体的投入量不宜过多，过多会导致线性化不完全，同时加入的酶量不可超过反应体系的1/10，酶切反应时间过长容易出现星活性，切出拖带。

反向PCR制备线性化载体，原理如下图所示。反向PCR的引物方向与常规PCR相反，但其设计原则与常规PCR相同。这种方法常常用来在载体中引入突变。使用反向PCR制备线性化载体时，需要使用高保真酶进行扩增，避免由于长片段扩增带来的点突变等问题。

图2.反向PCR制备线性化载体

反向PCR需要注意扩增的产物需要条带单一，若电泳出现非特异性条带则需要通过胶回收切下大小正确的条带。可通过调整PCR的退火温度，提高PCR产物的特异性。同时，建议加入DpnI酶进行质粒模板降解（模板最好来自甲基化功能未损伤的菌株），从而提高克隆的阳性率。

许多刚入门的学弟学妹在设计引物这一关就遇到了拦路虎。那么引物该怎么设计？一步法快速克隆的原理从本质上来讲是同源重组，需要在插入片段的两端加上同源臂，同源臂的长度一般为18-25bp之间。设计出来的引物需要包含两部分：一部分是用来扩增目的片段；一部分是用来与载体退火的同源臂。设计出来的引物要遵循引物设计原则：

图3.同源重组流程图

设计好引物之后接下来就是PCR产物的扩增，通常情况下，短片段（<1000bp）的克隆是较容易成功的，长片段的同源重组克隆就相对困难。在扩增长片段的目的DNA时，最好优先选择高保真酶，避免扩增出来的片段出现碱基的缺失或改变，试想一下好不容易挑了一堆克隆，就一个阳性，一测序发现碱基错了，氨基酸都变了，岂不是肠子都悔青了。

扩增好的PCR产物需要通过电泳检测PCR产物是否特异。好的PCR产物是单一且亮的条带（图4A）。那PCR扩增的片段出现非特异性条带（如图4B），该如何解决呢？

图4.PCR产物电泳图

注：A：特异性扩增PCR产物电泳；B：非特异性扩增PCR产物电泳

如果PCR产物出现（图4B）中的非特异性扩增条带。可以尝试通过凝胶电泳将条带跑开，然后将目的大小的条带进行切胶回收。除此之外，可以适当提高退火温度从而提高PCR扩增产物的特异性。如果扩增出来得PCR产物目的条带十分微弱，可以将PCR产物取0.1 L作为模板尝试进行扩增。扩增好的PCR产物推荐通过胶回收进行纯化以备后续酶连。

以上就是线性化载体的制备以及插入片段的制备问题，至于酶连和转化遇到的问题，我们下期再论。