编者按

近日，浙江大学药学院、组分中药国家重点实验室浙江大学交叉创新中心范骁辉团队与天津中医药大学第一附属医院樊官伟团队，在Small Methods（IF: 14.188）期刊发表了题为“Single-cell RNA Sequencing Reveals the Temporal Diversity and Dynamics of Cardiac Immunity after Myocardial Infarction”的论文，揭示了各免疫细胞对心肌梗死后损伤修复过程的动态调控作用，相关研究结果从免疫炎症调控环节深入诠释了丹参酮IIA治疗心肌梗死的具体机制，也为其临床应用提供了科学数据。欧易生物提供了该项目单细胞转录组测序和分析相关工作，下面我们一起学习这篇文章的具体内容。

材料：小鼠心脏中的Cd45细胞

期刊：

发表时间：2022年1月13日

方法：欧易生物10x Genomics scRNA-seq

研究背景

心肌梗死（MI）是世界范围内发病率和死亡率的主要原因之一，其特点是免疫细胞的招募与激活。免疫细胞参与心肌梗死后最初的促炎过程以及后来的抗炎反应，包括在伤口愈合或重塑中发挥作用。心脏免疫细胞是高度异质性的，它们在心肌梗死发展过程中的激活是不同的。一些细胞类型，如巨噬细胞和单核细胞，在心肌梗死的多种病理生理过程中起着核心作用，它们的起源和功能不同，由不同的亚群组成。然而，人们对心脏免疫的复杂多样性知之甚少。因此，需要对心肌梗死后心脏免疫的时间动力学进行系统分析，以开发特定时间的免疫调节干预措施。

研究内容

本研究对心肌梗死模型以及丹参酮IIA给药干预后第3、7和14天小鼠心脏中的Cd45细胞进行细胞类型鉴定、数量变化研究、发育轨迹判断和细胞间相互作用关系推测等分析。该研究主要集中在巨噬细胞上，巨噬细胞在心肌梗死后早期急剧扩张，在促进过度炎症反应或提供组织修复方面发挥了关键作用。M-5和M-6为主要的浸润亚群，炎症因子表达较强。同时该研究还确定了中性粒细胞和淋巴细胞群体的时间变化和作用，并且使用丹参酮IIA治疗后scRNA-seq数据分析解释了丹参酮IIA治疗心肌梗死的具体机制，同时为临床治疗心肌梗死提供了依据。

研究解析

1. scRNA-seq检测MI后不同时间心脏免疫细胞组成

为了识别不同的心脏免疫细胞类型，并综合表征其在心肌梗死病理进程中的动态变化，作者对心肌梗死（MI）后不同时间点（0、3、7和14d）小鼠心脏中的Cd45细胞进行scRNA-seq分析（Fig. 1a）。四个时间点反映着心肌梗死的主要阶段，对应着炎症细胞浸润以及心肌纤维化进程的增加（Fig. 1b）。通过降维聚类将细胞分为7个细胞群（Fig. 1c），并将每个细胞群的Top5差异基因进行热图展示（Fig. 1d）。第3天时巨噬细胞和单核细胞数量达到最高，并且在第7天时T细胞、B细胞、中粒细胞显著增加，14天时免疫组成与Sham组相似，表明成功控制住疾病（Fig. 1e）。上述结果表明，不同免疫细胞在不同时间点浸润，并通过不同的功能对心肌梗死作出反应。

Figure 1. 对心肌梗死中4个样本的心脏Cd45细胞进行scRNA-seq，揭示心肌梗死后7个免疫细胞群的动态

2. 通过功能定义不同心脏巨噬细胞亚型

巨噬细胞是驻留在心脏或侵袭梗死心肌的最丰富的免疫细胞。由于单核细胞与巨噬细胞存在潜在的分化关系，作者将单核细胞与巨噬细胞进一步降维聚类分为12个clusters（Fig. 2a，b）。对和的表达进行检测，发现其中M-1、M-2、M-3和M-4高表达，并且M-4低表达但却与M-1有共同的炎症基因（Fig. 2b，c）。在MI后第3天，M-2和M-3明显增多，而M-4在第3天后增加更加明显（Fig. 2d），表明高表达细胞群在MI进展的不同时间点展现出了不同的促炎功能。M-5和M-6都富集到了白细胞迁移和趋化相关特征，但是M-5高表达并且在第3天明显增加，另一方面M-6低表达并且具有更加复杂的功能，在0-3天过程中扩增了近4倍（Fig. 2b，c，d）。M-7、M-8、M-9和M-10低表达和为组织驻留巨噬细胞，其中不同细胞群展示了不同的功能以及变化趋势。M-11具有细胞周期和增殖标志物高表达和限制表达的特点。另外，免疫荧光染色结果表明，MI后第3天出现了大量巨噬细胞（Fig. 2e）。

Figure 2. 心肌巨噬细胞在心肌梗死进展中具有高度异质性和独特的功能

3. 心肌梗死后巨噬细胞亚群的动态变化

为探究MI后不同巨噬细胞亚群的动态变化，作者对巨噬亚群进行拟时序分析（Fig. 3a）。分析结果表明，时间起始于单核细胞，随后是高表达MHC细胞群，最后为驻留样或梗死后细胞群。M-5高表达并与单核细胞一起出现（Fig. 3b），因此可能是由单核细胞分化的典型梗死后炎症细胞群。而M-6出现在轨迹的最远处，并且有一部分与M-8共享同一分支，表明M-6起源于循环血细胞和自扩增的驻留细胞群（Fig. 3b）。为探究单核细胞与高表达、细胞亚群的发育关系，作者通过拟时序分析发现，M-2和M-3由具有炎症特征的M-1发育而来，而非直接由单核细胞发育而来（Fig. 3c），并使用热图展示了拟时序过程中的基因变化及GO富集结果（Fig. 3d）。另外拟时序结果还表明，在第3天单核细胞与巨噬细胞发生复杂转化，而第7天梗死亚群基本消失，M-1和M-4增加（Fig. 2d，3b）。

Figure 3. 单核细胞和巨噬细胞在真实心肌梗死进展和拟时序中的时间动态

4. 心肌梗死进程中巨噬细胞的时间特异性分子表达模式

为了进一步阐明心肌梗死环境下心肌巨噬细胞内的时间分子变化，作者分析了不同时间点的差异基因表达，并对基因进行GO富集分析。结果表明，MI后第3天上调基因富集为趋化因子或细胞因子活性，在早期白细胞浸润中发挥关键作用（Fig. 4a，b，c）；巨噬细胞在第7天的主要特征是抗原呈递和加工，促进适应性免疫反应（Fig. 4a，b，c）；在第14天与细胞外基质成分相关基因上调，参与细胞-细胞间和细胞-基质间相互作用（Fig. 4a，b，c）。上述结果阐明了心脏巨噬细胞的分子变化过程（Fig. 4d），作者通过免疫荧光染色进行了验证（Fig. 4e）。在心肌梗死进程中，代表不同生物学功能的特征基因表现出时间特异性表达。

Figure 4. 心肌梗死进展中巨噬细胞的时间特异性分子表达模式

5. 中性粒细胞及淋巴细胞亚群及其与巨噬细胞的动态相互作用

中性粒细胞是先天免疫系统中的主要细胞类型，可以调节心肌梗死后炎症反应，为探究中性粒细胞在MI进程中的异质性与可塑性，作者对改细胞群进行了降维聚类分析（Fig. 5a）。对不同时间点细胞亚群占比进行统计分析发现（Fig. 5b），N1细胞群特异性出现在第3天，并表达大量的趋化因子基因，引发心肌梗死部位其他免疫细胞大量外溢；N2细胞群作为另一个促炎亚群在心肌梗死后出现轻微扩增，对中性粒介导的宿主防御具有重要作用；N3细胞群在第7天最丰富，表达与凋亡信号通路相关的基因。对中性粒细胞亚群进行拟时序分析（Fig. 5c），发现随着表达量的升高，表达量逐渐降低（Fig. 5d），N3出现在轨迹末端，表现出最高的老化和凋亡评分（Fig. 5e）。为探究中性粒细胞与巨噬细胞间的交流，作者使用CellPhoneDB进行了细胞通讯网络分析（Fig. 5F），结果表明巨噬细胞通过与细胞粘附和趋化相关的配体受体对，与N1和N2的相互作用增加，而N3的迁移能力降低，表明在心肌梗死后第7天出现的最丰富的N3亚群推动从炎症期向修复期的转变，因为死亡的中性粒细胞有可能限制心肌梗死后的炎症反应。

T细胞与B细胞是心肌淋巴细胞的主要成分，作者对其进行了亚群分析（Fig. 5g，h）。T细胞分为7个亚群，其中CD8T在MI后第3天占主导地位；B细胞分为4个亚群，其中B2在所有时间点均存在，B细胞Ccl7介导单核细胞的招募，并且Ccr7可能增强B细胞抗原表达和迁移到T细胞区（Fig. 5i）。

Figure 5. 中性粒细胞和淋巴细胞的时间多样性和动态

6. 抑制早期浸润的M-5和M-6可减轻病理性MI进展

MI后第三天为急性炎症期，可能对疾病的调节至关重要，同时这个时期巨噬细胞明显扩增。为寻找对MI进行干预的关键细胞群，作者进行以下分析。对不同巨噬亚群对疾病贡献得分进行分析展示，发现M-5和M-6在所有巨噬细胞亚群中贡献得分最高，说明它们在加重疾病进展中起着至关重要的作用（Fig. 6a）。为进一步探究靶向M-5和M-6是否可以减轻缺血损伤，作者使用一种从传统药用植物丹参中分离出的天然心肌保护剂丹参酮IIA进行实验。使用心肌梗死模型以及丹参酮IIA给药干预后第3、7和14天小鼠心脏中的Cd45细胞进行单细胞测序（Fig. 6b），并将两组数据整合分析。结果表明，在第3天丹参酮IIA处理组，巨噬细胞和单核细胞明显降低（Fig. 6c），M-5和M-6作为两个优势亚群，丹参酮IIA处理后细胞比例显著下降60%（Fig. 6d），该结论通过免疫荧光染色实验进行了证实（Fig. 6e），表明M-5和M-6可能是丹参酮IIA干预的靶点。丹参酮IIA处理后M-5和M-6趋化因子表达明显降低，且M-5炎症相关组织蛋白酶降低，M-6中解决炎症相关细胞因子表达降低，表明M-5和M-6的细胞比例和功能基因都有可能成为干预MI的靶点（Fig. 6f）。上述结果表明，抑制早期浸润的巨噬细胞亚群（M-5和M-6）在减缓病状MI进展中的有效性，表明细胞类型和时间特异性干预的重要性。

Figure 6. 丹参酮IIA治疗证实了早期浸润巨噬细胞亚群抑制在减轻病源性心肌梗死进展中的有效性

研究结论

1. 巨噬细胞在心肌梗死后早期急剧扩张，在促进过度炎症反应或提供组织修复方面发挥了关键作用；

2. 丹参酮IIA的治疗表明，细胞类型和时间特异性的干预对心肌梗死具有有效的临床应用。

参考文献

Jin K, Gao S, Yang P, Guo R, Li D, Zhang Y, Lu X, Fan G, Fan X. Single-Cell RNA Sequencing Reveals the Temporal Diversity and Dynamics of Cardiac Immunity after Myocardial Infarction. Small Methods. 2022 Jan 13:e2100752. doi: 10.1002/smtd.202100752. Epub ahead of print. PMID: 35023642.

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