标签：引物设计 pcr扩增

PCR实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。其实验方法如下：

试剂准备：

PCR常用的试剂主要包括 DNA 模板、引物、ddH 2 O、 DNA 聚合酶以及特定的反应缓冲液、dNTP、MgSO 4（可选）和 DMSO（可选）。

二、PCR实验前的准备

在开始PCR实验之前，必须准备好DNA模板（基因组DNA或逆转录制备的cDNA）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)

1.DNA聚合酶。有许多商业 DNA 聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定 DNA 片段进行 PCR，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的Taq聚合酶。如果要对T-vector连接的片段进行PCR，要注意，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有A-tailing，所以应该选择普通的Taq聚合酶或在PCR实验后添加A-tailing。

2.引物的特异性影响 PCR 成功的概率，良好的引物设计对 PCR 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：

①引物的长度。PCR引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。

②熔化温度(Tm)。Tm 定义为在此温度下，DNA 双链体的一半将解离成单链 DNA。52-58C 范围内的引物 Tm 是最佳的。

③GC 含量。最佳 GC 含量应为 40-60%。

④许多软件可用于引物设计，例如primer5和Oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。

三、实验步骤：

根据PCR使用说明进行试剂混合预配，并设置 PCR 循环。

简而言之，PCR需要经过以下循环：

1.初始化步骤。这仅对热启动 PCR 必不可少。此步骤将溶液加热至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。

2.变性步骤。DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子。此时进入 PCR 循环。

3.退火步骤。变性后，反应混合物中的 DNA 模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 DNA 组装。

4.伸长步骤。在此步骤中，DNA 聚合酶开始合成 DNA，因此温度应为 DNA 聚合酶的最适温度。一般选择 72°C，但有些酶在 68°C 时效果更好。这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的能力。一般来说，DNA 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。

5. 2~4步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个 PCR 过程使用 30-35 个循环。在 PCR 循环的早期，PCR 产物以指数速率积累，而在 PCR 循环的后期，随着 dNTPs、引物的减少和 DNA 聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，PCR 速率逐渐下降。

6.最终伸长率。30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下最终延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链DNA。

7.贮存。最终产品可以在 PCR 机器中维持温度在 4-10°C。