2001年Raymond. Deshaies和Craig. Crews等人提出了Protac这个概念，并成功地设计合成了第一批多肽Protac用于降解甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP-2）。到了2019年，行业先驱Crews教授开发的ARV-110，以全球首个Protac药物的身份正式进入临床试验阶段，蛋白降解靶向嵌合体 (Proteolysis targeting chimeria，Protac)这类神奇的小分子越来越受到关注。
以泛素-蛋白酶体系统降解蛋白质为基础的Protac，与传统的抑制剂的作用机制大不相同,它往往不需要与靶蛋白特异性结合。只需要捕获靶蛋白形成E3连接酶-Protac-靶蛋白三元复合物就可以进行靶蛋白降解，因此能够对很多“无成药性”蛋白发挥作用。Protac药物的优势明显：用量小，毒性低；可以克服靶蛋白突变/过表达引起的耐药性；不依赖于亲和力，可选择性高；可以清除蛋白堆积。
Protac由三部分组成：一个与E3连接酶结合的配体，用于引导蛋白降解；一个与靶蛋白结合的配体，用于引导小分子的靶向定位；以及一个负责嵌合两个配体的连接子。本文主要介绍相关的E3连接酶配体以及连接子。
图1 Protac作用机理E3连接酶配体
在人类基因组中已经发现了600多个E3连接酶，但是其中只有少数被用于Protac设计。目前用于开发小分子Protac药物的E3连接酶，主要是MDM2、IAPs、VHL、CRBN、DCAF和RNF等，它们各有优缺点。[1]
1. MDM2-Protacs
最早的MDM2-Protac利用Nutlin-3a的衍生物作为结合配体降解雄激素受体（AR）。[2]虽然其并非是很有效的降解剂，但它为Protac降解靶蛋白提供了有力证据。再之后Idasanutlin的衍生物被用作MDM2结合配体，设计得到的Protac分子A1874可以有效降解溴结构域蛋白4（BRD4）。[3]
图2 A1874（蓝色：PEG3-linker 红色：Idasanutlin）
MDM2-Protacs选择性结合在MDM2表面的p53位点，可以同时稳定p53蛋白（抑癌基因）和降解靶蛋白，表现出更好的抗癌活性。但是，MDM2结合配体不易合成获得，这也导致了其应用的有限性。
2.IAP-Protacs
随着研究的深入，与凋亡蛋白抑制因子家族（IAP）的E3连接酶结合的配体已被用于Protac的设计。早期的IAP-Protacs利用Bestatin的衍生物作为靶向细胞视黄酸结合蛋白-1/2（CRABP-1/2）的IAP配体。[4] 再后来，LCL-161及MV-1的衍生物也被用作IAP的配体用于设计Protac降解BRD4, AR,ABL, ERα等靶蛋白。[5,6]
图3 SNIPER(BRD4)-1（蓝色：PEG4-linker 红色：LCL-161）
这一系列的Protac也被称为SNIPERs（specific and nongenetic IAP - dependent protein erasers）。 因为某些肿瘤细胞会通过引导IAPs上调来逃避凋亡，而SNIPERs往往可以同时降解IAPs和靶蛋白，从而发挥更强的抗肿瘤作用。
3.VHL- Protacs
小分子VHL- Protacs的特异选择性是由羟基脯氨酸决定的，最常见的VHL配体是(S,R,S)-AHPC及其衍生物。Protac分子MZ1所选择的BRD4结合配体尽管对BRD2/BRD3没有选择性，但可以选择性降解BRD4蛋白。[7]当然VHL-Protac还可以降解多种其它靶蛋白，包括ERRα、RIPK2、ABL、FLT3、FAK和TBK1。[8,9,10]大多数VHL-Protacs都是通过酰胺键与S-叔丁基-亮氨酸部分连接中间由聚乙二醇（PEG）或聚亚甲基组成的连接子，再连接到靶蛋白配体上。不过连接位点也不是唯一的，VZ185和ARD-69这两个Protac就分别展示了两种新型的连接方式。[11,12]
图4 MZ1（蓝色：PEG3-linker 红色：(S,R,S)-AHPC）
VHL-Protacs的主要优势在于其靶向特异性，同时对某些靶标它可能具有更好的肿瘤选择性。另外，VHL的E3连接酶与配体的结合亲和力不需要很高也是其优点之一。不过VHL-Protacs也有缺点。VHL是一种肿瘤抑制蛋白，在一些肿瘤细胞如透明细胞性肾细胞癌或肾癌中经常会发生突变。因此，VHL-Protacs不能用于治疗VHL基因突变或缺失的肾癌，需要谨慎优化剂量来避免VHL的抑癌功能。另外，VHL-Protacs的分子量往往较高，如何开发口服生物利用率高的VHL-Protacs也极具挑战。
4.CRBN- Protacs
自从一系列亚胺类药物被确定为CRBN的配体后，越来也多的CRBN-Protacs被开发出来。第一个CRBN-Protac分子dBET1以Thalidomide作为CRBN配体诱导BRD2、BRD3和BRD4的降解。[13]同年，ARV-825这种以Pomalidomide为配体的CRBN-Protac选择性降解Burkitt’s淋巴瘤细胞的BRD4。[14]以Lenalidomide为CRBN配体的BETd-260和QCA-570在体外实验中也获得了更好的降解效果。[15,16]CRBN-Protacs同样也可以降解例如BCL6，CDK8/9，PI3K，BTK，ALK，HDAC6，sirtuin，PCAF / GCN5，pirin和FKBP12等多种底物。另外，利用Pomalidomide与(S,R,S)-AHPC衍生物还得到了一种新型HOMO-Protacs，有趣的是其优先选择降解CRBN，而对VHL只是轻度降解。[17]
图5 ARV-825（蓝色：PEG4-linker 红色：Pomalidomide）
与VHL-Protacs相比，CRBN-Protacs可能会降解更大范围的靶蛋白。这是因为CRBN的蛋白结合面比VHL大，从而导致其具有更广泛的靶点适应性。另外由于CRBN在肿瘤细胞和正常细胞中广泛表达，因此CRBN-Protacs具有较小的组织选择性；而且CRBN-Protacs的分子量较低，其口服生物可利用性更高。
5.Others
除了上述四个常见的E3连接酶, DCAF家族和RNF家族也有可能被用于Protac的设计。例如，磺胺类药物indisulam通过募集 DCAF15 的E3连接酶来诱导 RBM39 降解，从而在许多白血病和淋巴瘤细胞系中发挥细胞毒性。
图6 E3连接酶配体及其靶蛋白
连接子
Protac的每个单元都影响着其蛋白降解性质，特别的，连接子的拓扑结构对生物学性质和理化性质都起着至关重要的作用。例如，前文提到的MZ1是由一个PEG3连接子与VHL的E3连接酶配体组成的Protac。其DC50 (半数治疗量)为＜100nm，并且Dmax达到96%。但当对连接子进行优化以及对VHL结合配体进行小修饰之后，得到的ARV-771不仅DC50＜5nm，Dmax更是达到了99%。[18]
图7 ARV-771
1.连接子结构影响因素
影响Protac性质的连接子拓扑结构主要在于三点：长度，刚性以及结合位点。首先，连接子的长度需要优化。如果连接子太短会发生空间冲突，从而破坏三元复合物，以至于降低Protac的降解能力。而如果连接子过长，会增加Protac两头的相对运动性，降低E3连接酶与靶蛋白的结合常数，从而降低三元复合物的稳定性。另外还会增加分子量，并可能降低其细胞通透性。
其次，提高连接子的刚性是改善Protac药代动力学特性和口服生物利用度的有效途径。连接子的适当刚性也可以限制Protac的生物活性构象，这可能改善靶蛋白的降解活性。
最后，靶蛋白配体和E3连接酶配体的连接位点的不同对Protac的二元结合亲和力、三元复合物构象以及理化和药代动力学特性均有显著影响。例如，利用Nutlin-3a作为结合配体的MDM2-protacs除了降解靶蛋白AR，还诱导自身泛素化从而降解cIAP1。为了克服自泛素化，MDM2配体的连接位点用酰胺基来取代酯基，就产生对cIAP1没有任何影响的Protac。[19]酰胺键、醚键、烷基胺、碳碳单键和碳碳三键都是常见的连接方式。
2.连接子类型
最初的连接子从柔性连接剂开始，如PEG或聚亚甲基链。亲水的PEG引入可以提高水的溶解度。而且在三元复合结构里氧原子可能与蛋白质残基相互作用，从而提供三元复合结构的协同性。
而芳香族、杂环和大环连接子结构可以最大限度地减少不利构象，从而实现Protac性质的优化。例如，亲水结构哌嗪具有改善水溶性和平衡亲脂性的潜力。
此外，点击化学中基于铜催化得叠氮-炔烃环加成(CuAAC)和Diels-Alder (DA)反应也可以用于Protac的制备。由此产生的带有杂环连接子的Protacs允许降解能力的快速验证。该技术还允许活性Protacs在细胞内通过自组装来实现蛋白质降解。
然而，在没有三元复合物共晶结构的前提下，发现最优刚性链还是十分有挑战性的。[20,21]
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参考文献
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