1. 定义：半定量是介于定量和定性之间的一种判定基因是否差异表达的方式。在控制其他变量同情况下，根据电泳条带亮度比较基因表达量的高低。

• 举个例子，有A和B两个基因，通过定量我们可以知道A和B表达的具体数值，分别是100和10，那么我们可以说在规定情况下A比B表达量高。而定性是，我们只知道A和B都表达，但是不知道他们的具体数值，无法比较表达量的高低。那么半定量就是，虽然我们不知道A和B表达的具体数值，但我们可以通过PCR的方式，在其他条件相同时，根据条带亮度判断A和B表达量高低，两两相比，亮的表达量就高，暗的表达量就低。

• 当然，半定量不但可以比较不同基因表达量的高低，也可以比较相同基因在不同材料中表达量的高低。比如，想知道A基因是否受到盐胁迫的影响，那么控制其他变量相同，改变模板（胁迫处理材料的cDNA），看A基因表达是否有变化。（以下过程就以相同基因在不同模板下的半定量为例）

2. 操作过程

2.1 半定量引物的设计

• 这个和平时设计的引物没有什么区别，注意事项也都差不多。有一点可能就是产物的长度最好保持在250-700 bp吧，最后跑电泳要能和引物二聚体区分开。拿到引物后要先PCR验证一下引物的特异性并摸索一下退火温度哦。（引物设计这里不细说了，要是有人想看这方面的可以留言~）

2.2 提RNA，反转录，内参基因验证cDNA模板是否可用。（如果想看RNA提取可以留言，在这里就不详细说了）

2.3 确定内参基因的平台期

• 我们知道，理论上随着循环数的变大，最后扩增出来的产物越多，那么反映到电泳上的就是条带会更亮。但事实上，PCR扩增也会有平台期，当反应中的某种物质（可能是dNTP或者引物等）被消耗尽，即使增加循环数，产物也不会再增加。所以，确定平台期的实质就是确定产物不再增加时的循环数。那么如何摸索循环数，来确定产物不再增加呢？那就需要我们做不同循环数的梯度PCR了，保证PCR过程中其他条件相同，只改变循环数（比如可以设计20.21.22.23.24.25.26等不同循环数），最后跑电泳，当条带明暗和粗细没有明显差异的那个循环数的前一个，即为达到平台期的循环数。

• 我用的内参基因是UBQ7，之前实验经验得出它达到平台期的最佳循环数是20-24。为了更确定，我还是做了验证，最后确定循环数为25。

2.4 用内参调平模板

• 想要比较基因在不同处理下的表达量，那么必须要控制模板量一致，才能使结果是有说服力的。（这一步是按需进行的，因为有的实验并不涉及到多个模板，则无需调平模板。）如何理解调平呢，就是保持PCR过程中其他条件不变，通过改变模板浓度，使得内参基因产物量相同（条带亮度相同）。所以，调平模板的实质就是使模板浓度/质量相同。

• 上一步，我们确定了内参达到平台期的循环数25。用该内参基因进行不同模板的调平。在这里我们有两种方式调平模板，第一是直接改变模板浓度，使得所有模板浓度相同，那么内参基因在特定循环数下亮度相同，这种方法比较浪费模板，所以我不常用。还有一种方法就是，把所有模板都稀释一定倍数（不能太低，要根据内参适当稀释），通过改变加入模板的体积来控制内参基因亮度相同，比如，你发现将模板都稀释十倍时，加入1ul A 模板与加入 2 ul B模板可以使得内参达到亮度相同，那么在进行最终半定量时，就可以按照这个比例加。

2.5 确定目的基因的平台期

• 这个和2.2是一样的，不再多说。不过这一步就比较浪费模板。

2.6 进行目的基因的半定量

• 改变模板（这里指的是受不同处理的样本），并保持目的基因循环数及其他所有PCR条件都相同，最后通过看电泳条带的亮度，来确定目的基因在不同模板中的表达是否有变化，以确定外部处理对目的基因是否有影响。当然了，亮度不同就是有影响了。

注：以上都是个人理解与总结，如有不同意见，欢迎提出。

下一期大家想看什么呢？讲讲引物的设计或者RNA提取？