植物组培技术发展了 100多年，广泛应用在植物的快繁、脱毒、种质资源保存和转基因方面，对植物育种、种质繁殖和保存、有机化合物的合成起到极大的推动和重要作用。植物组培快繁发展的同时，制约植物组培的 3大重要因素 :培养基污染、培养过程玻璃化和外植体褐化现象伴随而来。培养基污染主要与植物组培相关技术熟练程度有极大关系，已基本上解决。培养过程玻璃化在部分植物或者继代培养容易出现，随着植物组培技术的发展，也得到控制。外植体褐化现象比较普遍，特别是在木本科植物更容易发生，轻则影响植物生长发育，重则导致植物死亡，已成为制约这一技术推广的最大障碍。本文就此进行综述，以期降低植物组培褐化现象发生有所帮助。

1褐化现象的机理

目前，引起褐变机理主要是两个方面:一方面是非酶系列，主要是由于外界的不良环境引起的。如干旱、低温、高盐等引起细胞程序化死亡或自然死亡。另一方面是酶促引起，生成褐色物质如醌等。在正常细胞内，区域性分布使底物与多酚氧化酶 (PPO)等酶不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，发生一系列的脱水、聚合反应，生成醌，从而引起褐变。引起褐变的条件:氧、酶和底物，缺一不可。引起褐变的酶 :多酚氧化酶 ( PPO是主要的)、过氧化物酶 ( POD)、苯丙氨酸解氨酶等。引起褐变的酶的底物，主要是酚类化合物，可分成 3类:第 1类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸和莽草酸等 ;第 2类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁和木质素等;第 3类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮和芸香苷等。

2褐化的影响因素

2. 1外部自然条件

2. 1. 1光照

光照强度大小和时间长短是诱导外植体产生不定根和不定芽的重要条件。光的暗处理影响着植物组培褐化现象的发生，能明显推迟褐化发生的时间和降低发生几率。这是因为外植体酚类物质褐化需要酶催化作用，而酶的作用需要光诱导。周艳等以马缨杜鹃暗培养的抗褐效果较光照培养好，暗培养的最佳时间为 10 d。杜研等发现沙棘组织接种 5d的低温暗处理可以推迟褐变发生的时间、褐化率降低 30%。刘闻川等对槲蕨采用不同光照条件组织培养发现，1 000 lx光照最为适宜，槲蕨外植体的总酚含量、PPO和 POD活性最低。在蝴蝶兰的试验中，明显发现暗处理在 10 d能明显降低褐化效果，总酚含量、PPO和 POD活性较低 ;光照增强褐化现象明显升高。

2. 1. 2温度

大多数植物组织培养都是在 23～27 ℃进行，温度太高和太低都不利于外植体的培养。植物组培褐化关键抑制酚、醌和单宁物质的产生。这些物质产生主要是多酚氧化酶 ( PPO)、过氧化物酶 ( POD)等进行转换，植物体内的这些酶和温度有很大关系。PPO不耐热，最适温度一般为 30 ℃，或者 25 ℃。魏海蓉等发现，不同温度处理对 7年生甜樱桃 PPO酶的活性影响不一样，在低温 (5℃ )时 PPO活性较低，温度较高 (20 ℃ )时，PPO活性较高。赵伶俐等发现蝴蝶兰组培在相同 pH值(6. 0)下，温度越高，褐化率越高，PPO活性越强，总酚含量越高。

一般冬春季温度低，酶的活性较弱 ;夏秋季温度较高，酶的活性较强。冬春季植物枝条发生褐化现象比较轻，夏秋季反之。雷攀登等研究表明 :春季材料的外植体污染率、褐变率比秋季的低。周玉珍等发现，在 4—7月，露地和大棚的嫩枝褐化率均增高，7月最高。吴瑕等研究显示，春季休眠芽为外植体获得的沙棘组培苗防褐化效果较好。

2. 1. 3 pH值

植物组织中 pH值高低决定了培养基的软硬程度和渗透压，同时，pH值的高低可能对酚类物质和酚类氧化酶结合位点产生影响。在较低的 pH值条件下，使用较低浓度的琼脂，可适当控制其褐化数量。邬秀宏等研究茶树组织培养中当琼脂用量为 5.0 gL，pH值为 5. 6时，褐化率降低为 13. 3%。赵伶俐等发现蝴蝶兰培养基 pH值为 6. 5或培养温度 20 ℃时外植体褐化率最低。

2. 2内部微环境的调控

2. 2. 1培养基

大量的组培试验证明，培养基的类型、同一培养基不同浓度和大量元素及微量元素的多少对植物的组培褐化也有很大影响。程世平等显示黄连木培养基褐化速率，液体培养基＜半固体培养基＜固体培养基。在褐化严重程度方面，邱璐等发现随着培养基硬度的增加，褐化程度在减轻。黄燕芬等发现 12MS培养基较 MS培养基分别降低 5%和 6%，差异达显著水平。毛红俊等发现，白掌叶片在 12MS培养基中，抗褐化效果较好。李敬阳等指出，香蕉转化中改良的 MS培养基中铵态氮与硝态氮 (NH4 + NO3－)的摩尔比为 20. 6∶ 67. 6时，具有较强的抗褐化能力。周凤等［26］发现，桂朝 2号添加 5× CC微量元素，9311添加 3 ×CC微量元素可以明显抑制愈伤组织褐化，而特青对微量元素浓度反应不敏感。印芳等发现大量元素中 Fe、Cu浓度越高，蝴蝶兰初代培养褐化越严重 ; K、Ca、Zn随浓度升高褐变越轻。

2. 2. 2激素

激素在植物组培中的作用是促进诱导外植体的生长和分化，同时剂量的多少会影响组培褐化程度。细胞分裂素 (CK)会促进酚类化合物的生成和增强多酚氧化酶的活性，增加褐变。黄燕芬等发现高浓度的 CK极显著高于低浓度的褐化率，相似的结果也被其他试验重现。

2. 2. 3添加剂

在植物组培中，化学反应防止褐化因素，主要是在培养基中添加抗褐变剂和吸附剂 (木炭 )等。在不减轻褐化现象的基础上，吸附剂偏少较好，这与吸附剂不仅能吸附酚类物质，同时也能吸附微量元素和 Fe等元素。陈剑勇研究表明，Vc和半胱氨酸能有效控制褐化的发生，且不影响其生长，是杉木组织培养适宜的抗褐变剂。黄燕芬等表明，Vc、AC混合使用结果，褐化率较 CK下降 31%，抗褐化能力显著提高，腋芽萌动生长势良好。龚晓洁发现硫代硫酸钠 ( Na2S2O3 )、活性炭、Vc、柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 5种抗褐剂都能减轻马铃薯的褐化率，以 2.0 gL硫代硫酸钠和 8. 0 mgL柠檬酸的防褐效果最好。

2. 2. 4其他因素

植物组培褐化还有其他因素，如消毒时间、切割方式、转瓶时间间隔和外植体伤口大小等。黄燕芬等［23］研究表明采用 0. 1%的氯化汞溶液消毒 7～8 min，褐化率和污染率相对较低，利于腋芽萌动生长。杨爽等发现手掌参组培以 3d转瓶 1次褐化程度最轻，腋芽萌动生长情况最好 ; 9d转瓶 1次情况刚好相反。Gibson DM等［34］发现以 1～3个月褐化率最低。外植体伤口较大，醌类物质多，褐化严重。

2. 3外植体材料因素

褐化现象的发生与植物材料有密切的关系，主要有植物种类、品种、取材部位、取材大小等因素。不同种类植物褐化现象有差异，一般草本植物比木本植物发生褐化现象较轻。同一种类不同品种发生褐化现象的严重程度也不一样，巩慧玲等测定 5个菊芋品种，发现 3个北方品种总酚含量、PPO活性、POD活性各项指标均显著高于 2个南方品种，影响菊芋的 褐变。

同一品种不同部位褐化现象也是不相同的。植物枝条年龄和木质化程度成正相关，木质化程度越高褐化现象越严重。材料大小不一样，褐化程度也不一样。材料小褐化程度严重，材料较大，褐化较轻。李晓强等发现杨梅在 3个茎段部位中，以半木质化茎段诱导效果最好，褐化枯死率为 33. 33%。杜研等研究表明，选取 2周以后休眠芽作外植体褐化率与 1年枝条和 2年生枝条作为外植体的褐化率之间差异显著。王欢等［37］研究天女木兰表明，侧芽＜顶芽＜带芽的茎段褐化率。王宝宁等研究发现，野生春兰褐化率花萼＞花梗。陈贝贝等研究黄精叶钩吻组培，褐化率为叶片＞花柄＞茎。

3避免褐化现象的措施

植物组培育苗中，褐变是常见的现象。根据褐变发生的特点和原因，避免褐化现象的产生主要措施如下。

3. 1植物材料方面

选取褐变现象较轻的种类和品种。不同年龄的外植体在培养中褐变的程度不同，选取褐变程度较轻的材料。一般选取幼龄枝条比多年生枝条褐化率低，幼嫩茎褐化率比叶片低，材料较大的比材料较小的褐化率低，切口小的材料比切口大的材料褐化率低。不同季节，材料含的酚类物质和酶的活性不一样。处于休眠季节的枝条含酚类物质较少，褐化率比较低。

3. 2材料的预处理

在材料接种之前，对材料进行一些处理，能有效降低褐化现象。如对母株进行遮光处理，可以减轻一些品种 (月季 )的褐化程度。在控制一定污染率的情况下，灭菌时间越短，越能减轻外植体的褐化率。在接种之前用无菌水反复清洗，洗尽渗出的酚类物质，可减轻褐变危害作用。

3. 3组培基质微环境调控

植物组培培养基环境能很好调控褐化现象。一般来说液体培养基比半固体培养基和固体培养基褐化率低。高浓度无机盐会引起某些植物外植体中酚类物质的氧化，浓度越高褐化率越高。在一定范围，大量元素 Fe、Cu浓度越高，褐化率越高 ;微量元素偏多，会降低褐化率。生长调节物质使用不当容易褐化，细胞分裂素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，提高了褐化率。控制 pH值在一定范围能有效降低褐化率。

3. 4抗褐剂和吸附剂

常用的抗氧化剂包括抗坏血酸、硫代硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、血清白蛋白和柠檬酸等。用抗氧化剂溶液 (由浓度为0. 05%～0. 5%的柠檬酸和抗坏血酸混合而成 )处理外植体可以减轻褐化程度。Vc与木炭二者结合处理能有效降低褐化。

3. 5其他方面

对于褐化材料注意改善培养条件，加快继代转瓶的速度，及时更换新鲜培养基，可以减轻酚类物质，降低褐化率。植板密度增大，褐化逐渐加重。另外在组培中，经常筛选并剔除易褐变的细胞，也能降低褐化率。

4建议和展望

植物组培褐化现象的发生有轻有重;产生的原因有植物体内部原因和外部原因;培养的过程发生有初代培养和继代培养。利用现代科技手段减轻组培的褐化率，应用现代技术手段深入研究组培褐化机理，从组织结构、超微结构、染色体片段和控制基因等分子水平解释组培褐化变化过程，达到从根本上控制褐化现象的产生，从而使植物组培更好地为生产服务。

21世纪是植物组培的时代，植物组培与生物学、遗传学、药理学和光化学等学科结合，产生了巨大的生态价值和经济效益。为了消除或更有效地减轻植物组培褐化，是否可以尝试发展新的组培方式。如近年来发展的无糖组织培养方式，由 CO2代替糖作为碳源，调节组培生长微环境，从而为减轻污染和植物褐化提供了可能［40］。另一方面，利用生物技术培养植物新品种避免褐化的发生。这些技术及理论需要不断深入研究，相信在将来的工厂化发展中起到越来越重要的作用。

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