土壤微生物多样性的丧失加剧了抗生素耐药性的传播
17小蜗牛2021-03-19 16:21
一、相关信息
原文题目：Loss of soil microbial diversity exacerbates spread of antibiotic resistance recruiting beneficial microbes第一作者&通讯作者：Qing-Lin Chen & Yong-Guan Zhu期刊：Soil Ecology Letters
图1：文章信息二、文章摘要
生物多样性的丧失严重危害人类社会所依赖的生态系统过程。自然生态系统对外来物种入侵的抵抗能力不同，而这种抵抗能力可能取决于系统的多样性。然而，人们对微生物多样性为应对微生物入侵所提供的屏障知之甚少。耐药细菌的肆意横行是对21世纪公共卫生的严重威胁。因此，该研究探讨了减少土壤微生物多样性对抗生素耐药性传播的影响。
该研究使用稀释到灭绝，并结合高容量定量PCR的方法研究了微生物多样性和抗生素耐药性的入侵之间的关系。研究结果表明，微生物多样性与耐药基因丰度呈负相关。并且在考虑了孵育时间和微生物丰度等其他潜在驱动因素后，这种相关性得以维持。这说明高微生物多样性可以作为一个生物屏障，抵抗抗生素耐药性的传播。
研究意义：探讨了土壤微生物多样性在生态系统健康中的作用。
三、研究方法
1、实验设计
2016年8月于浙江省嘉兴市采集水稻农田表层土壤(0 ~ 20 cm)。土壤过筛分至< 2 mm，部分土壤经35 kGy的γ射线辐照灭菌。将剩余的土壤作为接种剂进行梯度稀释接种实验。将0.5 g灭菌土壤涂于含有色氨酸大豆肉汤(TSB)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的平板上，以检测辐照土壤的无菌性。6天后未观察到细菌或真菌的生长视为灭菌完全。
不同微生物多样性的土壤样品制造过程如下：将30 g未灭菌土壤与50 mL无菌脱盐水用紫外线灭菌混合器以最大速度搅拌5分钟配制成初始土壤悬浮液。将未灭菌土壤制成的土壤进行梯度稀释。选取4个浓度梯度，依次为未稀释（D0）、稀释100倍（D1）、10-4（D2）、10-8（D3），分别取5ml悬液加入到含有30g灭菌土壤的烧瓶中。使未灭菌土壤接种量依次为10-1、10-2、10-3、10-4。阳性对照和阴性对照分别为非无菌土壤(S)和无菌土壤(SS)接种相同体积的无菌水。
每个处理组为4个重复。每个烧瓶加入1.2 g猪粪作为耐药基因（ARGs）的来源。盖的无菌盖，在20°C、65%持水量（使用无菌脱盐水进行控制）条件下培养。每个处理组分别在第0、10、30、60和90天收集样品，用于分析细菌丰度、多样性，以及抗生素耐药性。
图2：实验设计2、分析内容
分别取0.5g土壤样品，提取DNA，并进行16S rDNA扩增子测序以分析细菌群落结构。采用高通量PCR的方法分析285种ARGs、8种转座子、2种整合子的相对丰度。
四、图文结果
1、微生物群落的组成和多样性
从所有样本中共获得7251527条高质量序列，每个样本的序列范围为40962 ~ 136022条。土壤微生物群落分布在17个门中。群落主要由放线菌门、厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、普朗克菌门和绿菌门组成，这些是世界范围内最常见的土壤细菌。与放线菌门和拟杆菌门相比，厚壁菌门的相对丰度随时间显著下降。据报道，厚壁菌门丰度的下降预示着随着时间的推移，土壤环境中肥料衍生微生物群的减少。不同稀释处理组间优势菌差异不大。但经过大量稀释后，变形菌门显著富集(P < 0.01)，特别是在孵育第10天。
通过计算Good’s coverage发现测序深度在所有样本中具有高度可比性，从94.25%到98.51%，表明测序深度可以足够可靠地描述细菌微生物组。正如作者预估的那样，稀释处理中物种丰富度(观测到的OTUs)逐渐降低。表明稀释-灭绝方法可以有效地控制土壤等复杂自然生态系统的微生物多样性。物种丰富度也随着时间的推移而降低。
基于样本间加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)进一步表明，稀释和培养时间显著改变了细菌组成的总体特征。沿着PC2轴，微生物群落通过初始稀释水平聚集在一起，解释了10.41%的总变化，而沿着PC1轴，微生物群落通过培养时间聚集在一起(解释了53.55%的总变化)。这一结果表明，时间对细菌组成的影响比稀释作用更大。
此外，作者还使用荧光量PCR检测了16S rRNA基因绝对丰度，以此检测了细菌丰度变化。结果表明，S和D0处理的细菌丰度在开始时(第0天)较高(因为原生菌群更丰富)，但随着时间的推移而下降。与S和D0相比，D1、D2、D3和SS(原生菌群多样性较低)的细菌丰度则更为稳定。
2、微生物抗药性组装和多样性
采用HT - qPCR检测了各样本ARGs的丰度和多样性。共检测到195个基因，186个ARGs，1类整合子整合酶基因和8个转座酶基因。每个样本中检测到的ARGs数目在47 ~ 116之间，平均85个。这些ARGs可对大多数常见的人类使用的主要抗生素类产生耐药性，如氨基糖苷类、beta-内酰胺类、大环内酯林考胺-链霉素B (MLSB)、多药外排、磺胺类、四环素和万古霉素等。这些ARGs的丰度范围在5.53×1010~1.65×1012拷贝/g土壤之间。在开始时(第0天)，S组的ARGs丰度更高，这是可能与土著耐药微生物类群的高丰度有关。这一观察结果与细菌丰度一致。稀释处理对培养10天后ARGs丰度开始变化，随着稀释程度的增加，ARG丰度增加。
图3：OTUs及ARGs丰度3、微生物抗药性与多样性的关系
作者使用普通最小二乘(OLS)回归模型来确定物种多样性和ARGs丰度之间的关系。分析结果显示，物种丰富度(OTU丰富度)的减少与ARG丰度的增加呈线性相关(P = 0.0016, R2 = 0.0810)。但相反地是，微生物Simpson多样性与ARGs的丰度呈高度负相关(P = 0.0003, R2 = 0.1043)。相比之下，均匀度与ARG丰度无显著相关(P = 0.8122, R2 = 0.0005)。
图4：OLS回归模型进一步分析发现， OTU丰富度与OTU多样性正相关(P < 0.0001, R2 = 0.4264)，而与OTU均匀度负相关(P = 0.0064, R2 = 0.0532)。OLS回归模型显示，ARGs丰度随着时间的推移而下降(P < 0.0001, R2 = 0.4065)。这一结果表明，施肥后的ARG丰度并没有保持急剧上升的趋势。
图5：ARGs丰度与孵育时间的关系因此，作者根据已知的效应和关系生成了SEM模型，以探究当考虑到其他可能的驱动因素时，微生物多样性和耐药性之间的关系是否能够得到维持？SEM模型是一种可以分离多种影响途径的检验方法，对于探索生态系统中复杂的关系网络较为有用。作者将稀释倍数、孵育时间和MEGs（转座子和整合子）以及细菌丰度都纳入到该模型中。模拟结果显示此模型解释了ARGs模式中86%的方差。培养时间和稀释度可以直接影响ARGs的分布模式，也可以通过强烈影响细菌的多样性和丰度以及MGEs的丰度来间接影响ARGs。细菌多样性显著且直接影响ARGs丰度(r = - 0.09, P< 0.05)，并通过强烈影响MGEs丰度间接影响ARGs(r = - 0.07, P< 0.05)。然而，细菌丰度对ARG丰度并没有显著的直接影响(r = 0.02, P > 0.05)。
图6：SEM模型举报/反馈
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