诺华TLR7/8小分子拮抗剂的发现及优化
药物化学前沿2020-08-06 12:58
背景
Toll样受体（Toll-like Receptors, TLRs）是一类分子模式识别受体，先天性免疫系统的组成部分。他们识别出各种与感染相关的特定分子并启动有效的免疫反应。TLR7和TLR8都位于内质膜，并能识别内体中富含胍/尿苷的单链RNA（ssRNA）。
TLRs的激活失调在多种自身免疫性疾病中发生，特别是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）。因为机体自身的RNA可以通过与自身抗体的复合物进入核内体。
TLR7主要在血浆树突细胞、B细胞中表达，而TLR8主要在单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞中表达。而自身免疫性疾病涉及到体内多种免疫细胞。
过去，TLR7/8拮抗剂的发现和优化主要依赖于表型细胞实验。
然而，TLR7和8的配体结合结构域(或胞外域，ECD)均位于核内体腔内，因此，表型细胞实验仅仅有利于鉴定在核内体腔内局部富集的化合物。因此，一些核内体TLRs拮抗剂的作用模式被认为是依赖于核内体局部高浓度拮抗剂与TLR配体寡核苷酸的结合，而不是直接与受体相互作用。尽管这样的化合物显示出细胞功效，但这种作用方式所需的几个基本基团会对理化性质、脱靶效应和药物累计产生负面影响。因此研究者开发了一种可以检测与TLR受体ECD直接相互作用的小分子的生化测试。由此发现并优化了系列高活性、高选择性的TLR7/8小分子拮抗剂。
TLR8拮抗剂竞争性测试
为了设计能用于高通量筛选的测试系统，研究者利用荧光素标记的拮抗剂建立起了一个配体竞争性测试系统。基于他们之前发现的化合物1，研究者将荧光示踪剂引入末端伯胺，得到探针分子2。
从苗头到先导
研究人员从诺华分子库大约50000个化合物中筛选出了苗头化合物3，将化合物3与TLR8 ECD进行对接发现（TLR7和8显示了高度的序列同源性，两者可能在结构和功能上均紧密相关。因此，基于已报道的TLR8晶体结构，研究者对其进行同源重组并作为参考），两个拮抗剂分子结合在两个TLR8 ECDs界面的两个对称的口袋上，形成一个同型二聚体。吡啶酮的羰基与Gly351的NH形成氢键相互作用，哌嗪的NH+与Glu427形成一个盐桥，喹唑啉母核位于结合口袋的疏水部分，与Phe495和Phe494形成面对边相互作用。同时，对接结果显示，Phe346、Tyr348、Val378形成的疏水口袋可以通过喹唑啉8位伸入。
在8位引入甲基，TLR8拮抗活性得到提高，然而TLR7的拮抗作用大大减弱，这一现象和原来的猜测（TLR7和8结构和功能类似）相驳，仔细对比TLR7和8序列发现，TLR7中有区别于TLR8的非保守氨基酸残基（紫色字体）直接与配体形成相互作用。
基于以上分析，研究者将喹唑啉替换为吲唑，以此避免分子的双环系统与氨基酸的空间碰撞，以及改变哌嗪的指向，避免其与Glu427（TLR8）的直接相互作用。
由于缺失了与TLR8中Glu427的直接相互作用，化合物5明显降低了与TLR8的亲和力，但也在一定程度上平衡了小分子对TLR7和8的效力。然而对TLR4和9的选择性依然不足。
在吡啶酮环上不同位置引入甲基，其中化合物8显示了较好的TLR7/8活性以及对TLR4/9的杰出选择性。被选为进一步优化的先导化合物。
先导优化
TLR8受体结合效力及渗透性是优化的关键参数。
研究者从三个位置（R,R',R''）进行优化，首先是吡啶酮部分。对接显示吡啶酮6位延伸方向仅仅狭小的空间可以进入。因此在6位引入一些小的取代基。此外，研究人员也将吡啶酮环化为5元并6元融合环，活性得到一定程度提高。
R'处的结构修饰显示，该位置的取代对活性尤其重要，稍微大的取代基可以增强其活性。
对接显示哌啶部分（R''）处于结合口袋的“出口”。因此该位置的修饰对活性影响不大，然而会通过碱性的改变来影响细胞活性。基于该位置的SAR，研究者保留了4-哌啶取代以便进一步优化。
化合物11与TLR8 ECD共晶
化合物11与TLR8 ECD的共晶显示，吡啶酮的羰基与Gly351的NH形成氢键相互作用，与Gln529*形成水分子介导的氢键，此外，吲唑N也与Tyr576*形成氢键。吲唑7位的甲基嵌入了氨基酸疏水口袋，而哌啶延伸至溶剂区，并未直接与Glu427发生相互作用。
组合优化
基于R,R',R''三部分独立的SAR，研究者继续探索组合两部分最优取代的修饰。得到的化合物25细胞活性大大提高，然而渗透性有所减弱，可能是吡啶酮部分的环化增加了化合物的极性从而限制了渗透性。
因此研究者在哌啶上引入F，通过轻微降低pKa来改善渗透性，同时确保不会对细胞活性产生消极影响。得到的反式3-氟哌啶衍生物活性优于顺式结构。其中又以化合物27在各种性质之间达到最佳平衡。
化合物27选择性及PK
化合物27显示了优良的选择性、体外理化和ADME性质及较好的体内PK，包括适中的清除率，杰出的口服生物利用度等。
体内功效
化合物27能剂量依赖性抑制小鼠内IFNα的释放，是一个有效的TLR通路抑制剂，有治疗TLR7/8驱使的自身免疫性疾病的潜力。
总结
区别于传统的基于细胞表型的测试，诺华的研究人员设计了一种配体竞争性测试方法，到目前为止，这是关于TLR配体结合测定法的首次报道，并且该测定法用作筛选工具能够实现TLR8拮抗剂的快速优化。
该系列优化的关键在于： 1.由TLR7序列比对引导的母核替换实现了双重TLR7/8拮抗作用；2.哌啶环上F的引入降低其碱性，得到了更好的PK性质及TLR8亲和力。
参考文献
ThomasKnoepfel, et al. Target-Based Identification and Optimization of 5-Indazol-5-ylPyridones as Toll-like Receptor 7 and 8 Antagonists Using a Biochemical TLR8Antagonist Competition Assay. J. Med. Chem. 2020. DOI:10.1021/acs.jmedchem.0c00130.
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