Science重磅！CRISPR领域两大“宗师”合作深度解析单碱基编辑器脱靶机制

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2012年，基因编辑领域两大先驱Jennifer A. Doudna和Emmanulle Charpentier合作发布了基因编辑史上的里程碑论文，为世界带来了革命性的CRISPR-Cas9系统。8年来，这把“基因魔剪”以惊人的速度在农业、药物开发和医学等领域得到广泛应用，并衍生出一系列基因编辑工具，成为人类改写自然遗传密码的首选基因组编辑器。

然而，此类技术往往无法在高效替换DNA特定碱基的同时保证DNA双链不断裂，另外，脱靶效应也阻碍该技术在生命科学领域的进一步应用。

近日，基因编辑领域两位“宗师”David Liu及Jennifer A. Doudna合作，在《Science》首次揭开了一种“最有前途”的碱基编辑器的3D结构，为调整碱基编辑器、使之在应用过程中更加灵活和可控提供了路线图。

DOI：10.1126 / science.abb1390

新版碱基编辑器“工作效率”提升1170倍

腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）是DNA的基本构成单元，按照A-T、C-G的配对形式搭建起了DNA的双螺旋结构。

2016年，David Liu开发出首个单碱基编辑器，能够在不切割DNA的情况下，靶向并结合DNA，将C-G碱基对替换为T-A碱基对。一年后，该碱基编辑器得到进一步优化，可将A-T碱基对转换回G-C碱基对。在人类遗传病中，该技术有望纠正大约60%（超过15000种）的致病单碱基变异。

在DNA中没有脱氨基酶的情况下，大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶（TadA）能够与Cas9蛋白质融合进化成ABE7.10，催化脱氧腺苷的靶向脱氨。在此基础上，ABE7.10变体可被进一步改进成为截短版本的miniABEmax以及ABE8e，后者是最新版本的腺嘌呤碱基编辑器（ABE），能够编码单个TadA域（TadA-8e），并与八个测试的Cas效应器广泛兼容。

无论是ABE7.10还是miniABEmax，早期的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）效率都很低。然而，最新的ABE8e却快到令人惊讶，对DNA的脱氨基速率比ABE7.10和miniABEmax分别高出590倍和1170倍。

活跃的脱氨酶蛋白是造成脱靶的“罪魁祸首”

尽管ABE8e能够在15分钟内完成近100％的预期基础编辑，但是这也意味着，ABE8e可能更容易针对无关的DNA片段进行编辑，造成脱靶效应。

为了解决这个问题，研究人员利用冷冻电子显微镜（Cryo-EM）成像技术，以3.2埃的分辨率解析了ABE8e结合DNA时的3D结构。其中，目标腺嘌呤被设计用来捕捉催化构象的模拟物所取代。

ABE8e捕获DNA时的Cryo-EM结构

研究人员观察到，ABE8e之所以具有更高的运行效率，是因为与此前版本的碱基编辑器相比，脱氨酶蛋白在两个点位上存在突变，这让蛋白质能够更紧密地抓取DNA，并更有效地将G替换为A。

该报告的共同第一作者、亚利桑那州立大学助理教授Audrone Lapinaite说：“这个3D结构让我们了解到，这一碱基编辑器实际上是以两个独立模块运行：一方面Cas9模块提供特异性，另一方面存在一个催化模块提供活性。这为我们提供了一种思考Cas9融合蛋白的方法，使我们知道了Cas9的哪个区域更适合融合其他蛋白。”

活性检测表明， ABE8e之所以容易产生更多的脱靶编辑，是因为与Cas9融合的脱氨酶蛋白始终处于活跃状态。在dCas9找到目标之前，会不断结合并释放成百上千个DNA片段。始终处于激活状态的脱氨酶就像一个失控的大炮，不等dCas9完全匹配到目标就已经对着碱基“开火”了。

加州大学伯克利分校的博士后研究员Gavin Knott博士说：“现在，我们不仅可以了解基因编辑器何时可以使用，什么时候不可以使用，还可以设计下一代基础编辑器，使它们更好，更适合临床。”

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End

参考资料：

[1] DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor.

[2] Cryo-EM Captures CRISPR-Cas9 Base Editor in Action.

[3]美国博德研究所David Liu：腺嘌呤碱基编辑器（ABE）

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