肽科普｜生物活性肽的制备——酶解法
哈喽老大2019-10-08 16:29
酶法水解全蛋白分子是生产生物活性肽的最常见方法，即通过合适的蛋白酶酶促水解蛋白中的肽键，从而使大的蛋白质分子水解为小片段肽和氨基酸。酶法生产活性肽具有许多优点：酶解过程和结果的可控性与可重现性强；酶解蛋白质条件温和、安全性高；酶解反应没有副反应并且不会降低蛋白质的营养价值。以上优点均为其标准化生产奠定了基础。当然，酶法多肽在调节水解pH的过程中，酸或碱的添加会引入无机盐，增加了分离纯化的难度。 酶解法制备活性肽的基本流程如下图1-4所示。
图1-4 活性肽的酶法制备与功能评价流程
首先，对于蛋白原料的选择，应尽量做到原料中蛋白含量较高和原料来源丰富、成本低两点要求。特别是利用某些食品加工废弃物或副产物进行生产的酶法活性肽，具有更高的商业利用价值。经过几十年的研究，酶解法生产活性肽的原料品种十分丰富，既包括动物原料如鱼肉蛋白、鸡蛋蛋白、酪蛋白、骨胶原蛋白和乳清蛋白等，也包括许多植物原料如大豆蛋白、小麦蛋白等。而目前，以乳和水产品为原料的酶解产物展现出了丰富的功能活性，正成为研究和应用热点。
蛋白质的预处理主要包括热处理、超声处理、高压均质和超微粉碎等操作，其目的主要是为了提高酶对蛋白质的敏感性。例如高压均质和超微粉碎有利于增大原料总表面积，从而使之与酶有更多的接触位点，缩短酶解时间、提高水解度。而热处理除了杀灭原料中原有微生物和组织自身的蛋白酶，防止微生物产生的酶和组织自身蛋白酶干扰正常水解外，还可以使蛋白质变性、结构松散，以便内部结构和酶接触。
酶法生产活性肽，蛋白酶是水解蛋白质的关键。现在商业化应用的酶按来源分为微生物源蛋白酶（如碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味酶）、动物源蛋白酶（如胃蛋白酶和胰蛋白酶）以及植物源蛋白酶（如菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶）三类。许多酶的切割位点具有特异性，表1-3列举了蛋白水解中常见几种内切酶的特异性切割位点，还有一些蛋白酶如一些微生物来源的蛋白酶不具有特异性。针对不同的底物，现多采用具有特异性的蛋白酶和非特异性的各类蛋白酶复配混合进行酶解。因为酶的复配往往具有协同增效作用，不仅有利于缩短酶解时间，提高水解度，还能获得较好的分子量组成和分布的酶解物。需要注意的是，水解产物的情况除了受所用酶的影响外，还受酶浓度、酶解时间、酶解温度、环境pH和底物浓度这五个独立因素的影响，为了使酶解过程可控并增强结果的可重现性，务必控制好以上五个独立变量。
此外，为提高酶解效率，微波、超声波、红外、磁性颗粒固定化酶等技术也有应用。以超声波辅助酶解为例，其主要作用在于通过产生的挤压、剪切等机械作用破坏蛋白质结构并打开亲水基团。结构打开的蛋白质更容易被酶结合，同时超声也加速了反应体系组分的充分混合，因而超声有助于酶解效率的提高。当然，超声辅助酶解往往比传统摇床酶解用酶量更少，节约成本。
蛋白原料酶解完成后的产物是一个十分复杂的混合物，其中可能含有单体氨基酸、氨基酸组成及活性强弱各异的肽段甚至未能完全水解的组分。为获得纯度较高的活性肽组分以供进一步研究或使用，需要对酶解产物进行分离纯化。
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