摘要

嗅觉使动物能够辨别环境中大量挥发性化学物质。这种化学信号调节了多种物种的行为，这些物种依赖于气味化合物来定位食物、识别领地、捕食者和有毒化合物。嗅觉也在配偶选择、母婴识别和群体成员之间的社会互动中发挥作用。评估气味嗅觉能力的一个关键测试是埋藏食物搜寻测试，该测试检查缺乏食物的老鼠是否能找到隐藏在动物笼子垫料下的食物颗粒。在这个测试中观察到的主要参数是测试小鼠发现隐藏在垫料下的一小块食物的潜伏期。如果测试鼠在特定的时间内不能利用气味线索来定位食物，就可以认为该鼠很可能有嗅觉能力的缺陷。多项研究证明，该类埋藏食物搜寻测试用来评估不同的小鼠模型的嗅觉缺陷具有较高的可行性。本研究使用这项测试证明了Ric-8B（一种与嗅觉特异性g蛋白相互作用的鸟嘌呤核苷酸交换因子）敲除小鼠表现出嗅觉受损。本文描述了在实验分析中采用的埋藏食物搜寻测试的参数。

关键词：埋藏食物搜寻测试，Ric-8B敲除小鼠，嗅觉行为测试，嗅觉损伤，嗅觉感觉神经元

研究背景

埋藏食物搜寻测试在1971年首次被提出。随后，该测试的其他版本也相继被开发。这个测试被用于研究嗅觉障碍在各种情况下的后果，如：分析嗅觉功能对雌性小鼠对雄性小鼠的社交行为的影响、区分主要嗅觉系统和犁鼻器官对个体行为或由硫酸盐代谢紊乱引起的低硫酸盐血症动物模型的参与。该测试还被用来评估神经元细胞粘附分子（Nrcam）缺失小鼠的社交能力和认知功能、研究选择性非咪唑类组胺H3受体拮抗剂在焦虑和抑郁样疾病中的作用，分析内源性大麻素对嗅觉感觉神经元的影响……当然，这些研究中使用的埋藏食物搜寻测试方法存在些许差异。例如，一些研究者在测试前让小鼠适应测试笼环境来减少嗅觉测试期间由新奇感引起的探索活动，这种适应有助于降低群体内的反应可变性。在过去研究中，研究者使用埋藏食物测试，以及其他相关的动机、行为和细胞测试，来确定嗅觉特异性Ric-8B敲除小鼠的嗅觉是否受损。本文描述了过去实验中采用的埋藏食物搜寻测试的参数，以求更全面的评估嗅觉缺陷小鼠。

材料和试剂

1. 小鼠（年龄≥8周）

注意：

a. 本研究使用了8周大的C57BL/6J小鼠，尽量保证实验用鼠年龄相同。

b. 该测试可与其他小鼠一起使用。且该测试可能也适用于大鼠，但需要标准化的程序，如：笼子的大小，垫料的深度，食物颗粒的大小，以及食物剥夺时间的长短。

c. 雌性动物发情会影响嗅觉辨别。考虑到这一点，本研究首先对性别进行了统计分析：野生型（4雄性和5雌性）、杂合子（3雄性和3雌性）和条件敲除小鼠（4雄性和5雌性）。然而，本研究没有观察到性别之间的差异，所以在最终的结果中，本研究没有进行将性别因素考虑在内。但本文建议在决定是否使用混合性别组之前，评估一下性别之间的差异。

2. 过滤且高压灭菌过的水

3. 食物颗粒（食物做成的球状物）

注意：

a. 本研究使用了2g的食物颗粒，这些颗粒与小鼠平时喂食的食物相同。

b. 本研究使用AIN-93G饲料(用于快速生长、怀孕和进入哺乳期）。

c. 其他类型的食物可包括：奥利奥饼干、凯洛格水果圈、覆盖着花生酱的食物等等。然而，本研究发现，凯洛格的水果环并没有通过嗅觉线索刺激老鼠的觅食行为。在本实验中，常规的食物颗粒在觅食行为方面比水果圈表现更好。这可能是由于小鼠新奇心理引起的，所以本研究建议使用动物习惯的食物刺激，以避免新奇性心理对实验结果产生影响。

设备

1. 实验动物室

注：一个足够大的测试空间对于行为测试的结果至关重要，以避免外部干扰。在规划阶段应仔细考虑这一要求。一个成功的测试室应包括一个独立且安静的房间，并在测试期间避免闲人进入。

2. 清洁后的小鼠笼（长30.5厘米，宽16厘米，高16厘米）（图1）

注：不要使用常规的笼盖。容纳食物和水的不锈钢笼盖会影响观察，不建议使用。如果需要，最好使用丙烯酸制的盖子。

图1|埋藏食物搜寻测试布置图（这个实验测试的目的是测量动物利用嗅觉线索进行觅食的能力。在这个测试中测量的主要参数是找到隐藏的食物的潜伏期。潜伏期被定义为当老鼠被放在笼子里和当老鼠发现食物颗粒之间的时间。在测试中，8周大的小鼠被剥夺了24小时的食物，但可以随意喝水。第二天，一粒2克的日常食物被埋在一个干净的测试笼子的一端，在新鲜垫料表面下8厘米处。动物放置的位置和颗粒被埋葬的位置保持不变）

3. 干净的笼子垫料，在每个笼子中创造一个8厘米的垫料层

注：

a. 对于每个受试鼠，应使用由动物护理笼清洗设施，清洗并干燥清洁笼，最后换上干净的垫料。不要重复使用笼子或垫料。

b. 垫料：本研究使用Premium Hygienic Animal Bedding LIGNOCEL® FS-14埋藏食物颗粒。

4. 便携式数字秤（Denver Instrumen，型号：TR-403或同等秤）

注：本研究使用的数字秤最大称重量为410克，误差为0.001g。

5. 数字秒表

注：秒表用于检测小鼠找到食物的延迟时间。

6. 数码摄像机（本研究使用的是Sony Cyber-shot 14.1 mega pixels)（索尼，型号：SCW330）

注：

a. 人的观察可能会影响动物的行为。使用摄像机可能有助于减少在测试过程中人的干扰。

b. 所有视频均以.avi格式录制，并使用VLC媒体播放器观看

测试程序

1. 在测试剥夺受试鼠食物24小时，从笼子中取出所有的食物。检查笼内以清除可能散落在笼内的颗粒碎片。不要取下水瓶。

注：在标准化过程中，本研究尝试使用6周大的小鼠，但结果不明确。因为6周龄的小鼠仍然被认为是幼年小鼠，并且在行为上表现出更大的可变性，因此应该用8周龄或更大的小鼠进行行为测试。

2. 在第2天，在埋入食物颗粒之前，建议让小鼠在相同的测试条件下适应测试笼中的环境。适应期应与试验持续时间一样长，并且应在埋入食物颗粒之前将小鼠从笼子中取出。

3. 将食物颗粒买入垫料之下8厘米处，开始测试。将小鼠转移回测试笼子中，并置于与食物颗粒的相反的角落。从它被转入测试笼直到找到食物颗粒的时间被记录为潜伏期。一旦小鼠触摸到食物颗粒，就立刻停止计时。如果动物在10 min内无法找到食物颗粒，则终止测试，并将潜伏期记录为600秒。对于每个受试鼠，都应该使用一个干净的笼子、垫料和食物颗粒。

4. 在搜寻食物的行为中，控制小鼠动机是很重要的。这可以通过未埋藏的食物搜寻测试或其他动机和运动测试来实现。未埋藏的食物搜寻测试是控制动机的最简单的方法。它可以在一周后使用平行对照组（在接受未埋藏食物搜寻测试的同时，测试组进行埋藏食物搜寻测试）或在埋藏食物搜寻测试中使用的相同动物。未埋藏的食物搜寻试验与埋藏的食物搜寻试验相同，只是该测试的食物颗粒在垫料的表面。因此，该测试并不依赖于嗅觉线索和对组间动机水平的控制。

注：

a. 如果动物在测试期间或测试之前逃离笼子，则不统计该动物的测试数据。

b. 在Machado等人的研究中，在通过嗅觉损伤测试行为差异时，研究人员使用了三组小鼠：测试组（条件敲除，n = 9）和两个对照组（野生型，n = 9；和杂合子小鼠，n = 6）。与对照组相比，测试组提取食物颗粒的潜伏期更长（WT 143.1 ± 30.2秒；Het 188.3 ± 24.5秒；cKO 378.5 ± 76.3秒；p = 0.02，F（2,15）= 4.54，one-way ANOVA and Dunnett post-test)）。值得注意的是，本研究让小鼠适应了测试室，但未适应笼子。对笼子的进一步适应可能会导致两组之间出现更显著的潜伏期差异（图2）。此外，本研究没有进行未隐藏的食物寻求测试，仅通过旷场测试、明/暗室穿梭、高架十字迷宫和悬尾测试来评估受试鼠的动机和运动能力。

图2|埋藏食物搜寻测试结果（Ric-8b条件敲除（cKO）小鼠需要明显更长的时间才能找到食物。WT（n = 9）、Het（n = 6）和cKO（n=9））

c. 为了评估雄性和雌性小鼠之间的可能差异，Machado等人将小鼠按性别分为三组：野生型（4只雄性和5只雌性）、杂合子（3只雄性和3只雌性）和条件敲除小鼠（4只雄鼠和5只雌鼠）。然而，在初步统计分析后，本研究观察到性别之间没有差异，因此最终结果未考虑性别差异。

数据分析

1. 实验设计中每组试验至少使用3只动物。

2. 动物搜寻到食物颗粒所需的时间（潜伏期）以秒为单位测量，最大值为10 min（600秒为最大分数）。

3. 任何首选的统计程序都可以用于统计分析。要比较两个数据集，应使用Student’s t-test。要比较三个或更多的数据集，请使用One-way ANOVA and post-hoc Dunnett或类似的方法。对于数据的非正态分布或小群体，使用曼-惠特尼检验代替Student’s t-test，使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验代替One-way ANOVA。在P≤为0.05时被认为是显著性差异。

注意事项

1. 行为测试的结果可能会受到许多因素的影响，如实验室温度、噪音和动物的昼夜节律。因此，实验应该选在同一天的同一时间进行，并应考虑动物的昼夜周期，在一个独立且安静的房间中测试，避免在测试过程中有外人进入。强烈建议将动物在一个专门用来适应的独立房间里适应，且这个房间应该与测试室相似。

2. 一个实验者应该完成一个完整的实验，以减少可变性。如果使用多个分组的小鼠，最好是同一实验者对所有小鼠进行测试，以减少可变性。

3. 本研究建议进行双盲测试。做视频分析的实验者应该对实验组盲测，以避免个人主观误差。

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