PCR浅谈之聚合酶链式反应知多少
易博远生物2021-07-18 14:12
一、定义与原理
1定义：Polymerase Chain Reaction,简称PCR,又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。聚合酶链式反应(PCR) 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
2.原理：以扩增的目的基因DNA分子为模板,必须采用针对特定目的基因的特异性引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA的合成。
二、应用：
（1）用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，定性判定核酸含量
（2）用于疾病的诊断或任何与DNA、RNA相关的研究
三、特点：
（一）特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。要点分析：其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过合理的引物设计，选择特异性和保守性高的靶基因区域，其特异性程度就会更高。（二）灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
（三）简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增仪和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，可以不使用同位素，无放射性污染、易推广。
（四）对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。以源于临床标本（如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等）的粗制DNA进行扩增检测。
四、实验方法
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
五、反应体系：
（一）各试剂组分及比例
（二）模板（template）
1.模板DNA的来源：
1）从细胞中提取DNA：血细胞，动植物细胞，毛发等
2）从微生物中提取DNA
3）固定和包埋的组织标本
2.模板DNA的浓度：0.1-2μg/100μl体系
3.DNA提取与保存
1）要裂解的样品数量，配制适量1 × 裂解液
2）取200 μl 1 × 裂解液加入到所需裂解的组织中，涡旋振荡后在55℃水浴中孵育20 min。
3）孵育完成后，将样品置于95℃或者沸水浴中加热5 min。
4）将裂解产物涡旋振荡充分混匀后，12,000 rpm离心5 min，取上清即可进行PCR反应。也可将上清转移至另一个灭菌EP管中，-20℃可存放至少三个月。
（三）常见模板DNA制备试剂盒
1.按照类别分类：哺乳动物用PCR试剂盒、植物用PCR试剂盒、微生物用PCR试剂盒
2.其他分类：全血类试剂盒，胶回收类试剂盒，PCR产物类试剂盒
（四）引物（primer）
1.引物是PCR特异性反应的关键
2.PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度
3.理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增
（五）酶（Taq DNA polymerase）
1.来源：一种是从栖热水生杆菌中提纯的 天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
2.酶量：1-5U/ 100μl体系
（六）dNTP
1.浓度：50-200μM
2.dNTP的浓度要相等
3.高浓度dNTP能与Mg2+结合，使游 离的Mg2+浓度降低，影响DNA聚合酶活性。
（七）缓冲液（buffer）
1.维持Taq酶扩增的最适条件和稳定性
2.Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活剂
六、模板制备
（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
七、PCR反应条件控制
1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。（注：2×Taq Plus Master Mix (Dye Plus)解冻完全后，上下颠倒混匀。）
5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反应温度
（1）变性温度和时间95℃，30 s。
（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
八、（琼脂糖凝胶）电泳原理及操作
（一）原理
1.在电泳缓冲液中，DNA带负电荷，在电场作用下向正极移到（电荷效应）
2.小分子移动快，大分子移动慢（分子筛效应）
3.闭环超螺旋移到速率大于线性DNA（分子构象）
（二）电泳的流程：
1.称量：配置1%的琼脂糖凝胶，三角锥形瓶中加入100ml的0.5×TBE缓冲液和1g琼脂糖粉，适当混匀
2.混匀、加热、溶解：将锥形瓶放入微波炉中加热溶解琼脂糖，冷却至50-60℃左右，加入核酸染料，并充分混匀
3.制胶：将琼脂糖溶液倒入制胶模中，插上梳子。室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时
4.上样：分别取5μl marker和10μl扩增产物加入样品孔中
5.电泳：加完样后，接通电源，100-120V，开始电泳，当条带移动到胶块2/3以上时，停止电泳
6.显影：在凝胶成像系统中拍照并观察
（三）注意事项：扩增产物直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，无需添加DNA Loading Buffer。
九、扩增产量低或者无法扩增原因分析及解决办法
模板：含有Taq酶抑制剂、杂蛋白，模板上样量低或模板降解解决办法：纯化模板并重新提取，并检测模板是否含有抑制剂引物：引物降解，引物设计不合理解决办法：重新设计引物并低温保存试剂：酶失活，buffer不合适解决办法：优化buffer，摸索镁离子浓度反应条件：退火温度高，延伸时间短解决办法：提高退火温度，增加延伸时间
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