新型RNA去甲基化酶
BioArt生物艺术2021-07-13 16:40
近年来， DNA与RNA去甲基化酶及其发挥的重要生物学功能受到了表观遗传学、生物医学等领域的广泛关注。对于哺乳动物信使RNA（mRNA）中高丰度的6-甲基腺嘌呤（m6A）甲基化修饰【1，2】，美国芝加哥大学何川教授团队在2011年和2013年分别报道了FTO和ALKBH5作为mRNA上m6A的去甲基化酶，打开了 RNA表观遗传学的新篇章【3,4】。在随后的几年中，FTO与ALKBH5作为m6A去甲基化酶在急性骨髓性白血病、癌症干细胞等方面的重要功能也逐渐被研究人员所揭示【5-8】。除了mRNA，何川教授团队在2016年报道了ALKBH1调控细胞质转运RNA（cytoplasmic tRNA）上m1A去甲基化并进一步影响翻译【9】。作为人类ALKBH蛋白家族的另一个成员，ALKBH7蛋白被证实定位在哺乳动物细胞线粒体中【10-12】，有趣的是，与敲除FTO的老鼠模型类似，研究人员在2013年发现Alkbh7能促进老鼠体内脂肪酸的利用，进而观察到Alkbh7基因敲除的老鼠在体重和体脂上体现出双重显著增长【10】。然而，对于ALKBH7如何调控细胞代谢、是否具有核酸去甲基酶活力（或催化类型）等，人们尚不了解。ALKBH7在活性位点周围的结构与突变型大肠杆菌AlkB工程酶（D135S/L118V）体现出一定的类似性，考虑到该突变型AlkB工程酶（D135S/L118V）具有m1G与m22G上的去甲基化活性【13】，这引发了关于ALKBH7是否是一种天然存在的线粒体RNA鸟嘌呤（G）去甲基化酶的猜测。
2021年7月12日，芝加哥大学何川教授与上海科技大学刘如娟教授共同通讯在Nature Cell Biology在线发表了标题为ALKBH7-mediated demethylation regulates mitochondrial polycistronic RNA processing的研究论文，该研究表明ALKBH7在细胞内主要对线粒体多顺反子RNA上的m22G和m1A进行去甲基化，进而调控线粒体RNA的加工成熟过程。该工作由芝加哥大学、上海科技大学、挪威奥斯陆大学和中国科学院分子细胞卓越创新中心的研究人员共同参与完成。
研究人员首先运用高效液相色谱仪-串联三重四极杆质谱技术（LC-MS/MS）对于ALKBH7基因敲除的HepG2细胞线粒体RNA（mt-mRNA，mt-tRNA，mt-rRNA）上的几种常见甲基化修饰进行了总体水平的检测，但并没有发现修饰水平的显著变化。研究人员推测有可能ALKBH7介导的去甲基化发生在RNA上的特定位点，而非质谱通常检测到的整体效应。研究人员随后以突变型大肠杆菌AlkB工程酶（D135S）为基础【14】，优化了体外去甲基化反应的反应条件，开发了Demethylation-Assisted Multiple Methylation sequencing甲基化测序方法（DAMM-seq），能高效擦除并一步识别m1A、m3C、m1G与m22G四种RNA甲基化修饰，并且可对微小量RNA进行建库测序。同时，这四种甲基化修饰所产生的反转录碱基变异（RT misincorporation）信号，可被用于甲基化程度（methylation fraction）的定量估计。运用DAMM-seq，研究人员对诸多种类的线粒体RNA进行了甲基化测序，并在ALKBH7基因敲除前后监测了不同甲基化位点处碱基变异（misincorporation）信号的变化，发现ALKBH7基因敲除可以显著提升线粒体双链RNA（dsRNA）上Ile-tRNA区域m22G与Leu1-tRNA区域m1A的甲基化程度。进一步的，研究人员运用大肠杆菌表达的重组ALKBH7蛋白，对ALKBH7的去甲基化酶活性进行了体外生物化学（biochemistry）验证。研究人员依照线粒体Ile-tRNA与Leu1-tRNA的序列合成了分别携带m22G与m1A的RNA探针，验证了ALKBH7重组蛋白对于这些序列中的m22G与m1A甲基化在单链RNA（ssRNA）、双链RNA（dsRNA）以及折叠态tRNA（folded tRNA）均具有显著的体外去甲基化酶活性。
线粒体RNA具有独特的转录、加工与成熟的过程，线粒体DNA（mtDNA）上快速的双方向转录会产生两条长链的、可以彼此序列互补的未加工多顺反子RNA（unprocessed polycistronic RNA），进而一部分区域可以形成线粒体双链RNA（dsRNA）。在这一系列的未成熟线粒体RNA中，13个线粒体mRNA、22个线粒体tRNA和2个线粒体rRNA是连接在一起的，线粒体tRNA作为连接点（junction site）将不同的mRNA间隔开， 所有的线粒体mRNA和tRNA会在进一步的加工与成熟过程中，从长链的线粒体polycistronic RNA中剪切与释放。然而，目前人们对于这些线粒体mRNA、tRNA与rRNA基因表达的具体调控机制尚不完全清楚。由于ALKBH7主要调控线粒体polycistronic RNA上Ile-tRNA与Leu1-tRNA区域的去甲基化，研究人员推测其可能影响修饰位点周边和下游tRNA和mRNA的加工与成熟, 进而调控线粒体基因表达。通过从大量细胞中富集了线粒体dsRNA（来自于ALKBH7基因敲除与对照组），以及用新鲜的线粒体裂解液对其分别进行了体外处理（in vitro），研究人员发现Ile-tRNA与Leu1-tRNA连接点（junction site）在ALKBH7基因敲除情况下被切割的更快，并且这一加速效应会蔓延至下游的几个连接点。研究人员进一步研究了微小量线粒体dsRNA上的二级结构，并捕捉到了一个位于Ile-tRNA区域下游大概70 nt的ssRNA区域（位于H链的非编码区域），该区域的ssRNA水平在敲除ALKBH7之后体现出显著下降，说明ALKBH7蛋白量减少所引起的m22G甲基化升高会促进这一区域的RNA折叠，并进一步推动其周围及下游的剪切与加工。
为进一步研究ALKBH7对线粒体RNA的加工、调控机制，研究人员运用5-ethynyl-uridine（EU）代谢标记方法，提取了线粒体内新生成的RNA并进行了13个连接点处的切割速率的体内监测（in vivo）。在10分钟EU标记的RNA中，ALKBH7基因敲除加快了几乎所有tRNA连接点处的切割速率并导致几乎所有EU标记的mRNA量下降。通过进一步DAMM-seq测序，研究人员证实了EU标记的早期RNA里，ALKBH7基因敲除所导致的异常加速切割和加工，会导致pre-tRNA和新生mRNA的降解，这一效应会最终导致大部分成熟态线粒体tRNA的含量下降，从而减弱线粒体内翻译过程、降低线粒体编码蛋白的蛋白量、削弱线粒体呼吸代谢。然而，对于成熟态线粒体mRNA，研究人员发现几乎所有的mt-mRNA都总体上体现出了含量的上升，暗示了ALKBH7基因敲除下的异常加工会生成更稳定的mRNA。研究人员在Alkbh7基因敲除的老鼠模型中，检测了多种组织并观测到成熟态线粒体tRNA量与mRNA量的变化趋势与在人细胞系中观察到的类似。并且，在老鼠BAT脂肪组织中，Alkbh7的敲除会降低OXPHOS复合物功能并减弱脂肪酸氧化的速率，进而与肥胖表型密切联系。
何川教授团队及其他团队的近期研究工作不仅展示了一系列m6A修饰对于核编码基因mRNA调控，也证实了染色质相关RNAs上的m6A修饰可调控染色质状态和转录【15】。相比之下，RNA修饰如何调控哺乳动物线粒体内的转录机制鲜少有报道。本文阐释了一种新型的、工作在线粒体polycistronic RNA上的m22G/m1A去甲基化酶，建立了通过调节“内嵌型”tRNA连接点上的甲基化程度进而控制周边RNA折叠与剪切、加工速率的模型，证实了这一去甲基化行为对于pre-tRNA和新生mRNA量的改变，从而影响成熟态tRNA与mRNA表达量、线粒体翻译、OXPHOS功能、线粒体呼吸等方面，提供了一种RNA甲基化在pre-RNA加工层面调控线粒体基因表达的新思路。ALKBH7在调控线粒体基因表达中的重要角色，以及Alkbh7基因敲除老鼠所呈现的肥胖表型，使得ALKBH7成为一系列线粒体相关疾病的潜在靶点，如线粒体功能损失引发的代谢疾病、癌症及神经元疾病等。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41556-021-00709-7
参考文献
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